V. TÃ¼berkÃ¼loz Lab. TanÄ± YÃ¶ntemleri Uyg. Kurs KitabÄ± - Klimik

PROF.DR. AYfiE YÜCE 

PROF.DR. AHMET SAN‹Ç 

DOÇ.DR. MUSTAFA ÖZYURT 

PROF.DR. SÜHEYLA SÜRÜCÜO⁄LU 

DR. NEV‹N SARIGÜZEL SAR 

PROF.DR. MELTEM UZUN 

DOÇ.DR. GÜLDEN ERSÖZ 

YRD.DOÇ.DR. NUR‹ ÖZKÜTÜK 

DR. V‹LDAN AVKAN O⁄UZ 

DOÇ.DR. AHMET K‹Z‹RG‹L 

YRD.DOÇ.DR. TUNCER ÖZEK‹NC‹ 

YRD.DOÇ.DR. HÖRÜ GAZ‹ 

DR. ERDAL ÖZBEK 

DR. SEV‹M MEfiE

‹Ç‹NDEK‹LER 

Düzenleme kurulu.................................................................................................04 

Önsöz .....................................................................................................................05 

Kurs Program›........................................................................................................06 

Kurs kuramsal program› .......................................................................................07 

Uygulamal› e¤itim konular› ve gruplar›...............................................................08 

Uygulamal› e¤itim-rotasyon program› ................................................................09 

Tüberküloz laboratuvar›nda çal›flma prensipleri (WHO karar›) .........................13 

Klinik materyalin hastadan al›nmas› ve laboratuvara gönderilmesi..................15 

(Meltem UZUN) 

Örneklerin ifllemlenmesi ve kültür yöntemleri ....................................................22 

(Gülden ERSÖZ) 

Direk mikroskopi teknikleri ve de¤erlendirilmesi ...............................................27 

(Nevin SARIGÜZEL SAR) 

Auramine-Rhodamine floresan boyama..............................................................34 

(Vildan AVKAN O⁄UZ) 

Tüberküloz basilinin klasik yöntemlerle identifikasyonu ...................................39 

(Süheyla SÜRÜCÜO⁄LU) 

Antibiyotik duyarl›l›k test yöntemleri..................................................................52 

(Nuri ÖZKÜTÜK) 

Tüberküloz tan›s›nda klasik pcr............................................................................78 

“PCR ve RFLP Yöntemleri ile Mycobacterium Türlerinin ‹dentifikasyonu” 

(Ahmet SAN‹Ç, Ahmet K‹Z‹RG‹L) 

Tüberkülozun moleküler tan›s›nda ticari sistemler.............................................90 

“‹zotermal Dizi Yer De¤ifltirme Amplifikasyonu Tekni¤inin Kullan›m›” 

Strand Displacement Amplification (SDA) 

(Mustafa ÖZYURT)

KURS DÜZENLEME KURULU 

KURS BAfiKANI 

Prof. Dr. Ayfle YÜCE 

Klimik Derne¤i Tüberküloz Çal›flma Grubu Baflkan› 

DÜZENLEME KOM‹TES‹ 

Ayfle YÜCE 

Eralp ARIKAN 

Ahmet SAN‹Ç 

Mustafa ÖZYURT 

Süheyla SÜRÜCÜO⁄LU 

Nevin SARIGÜZEL SAR 

(BAfiKAN) 

(BAfiKAN YARD. YEREL KOORD‹NATÖR) 

(BAfiKAN YARD.) 

(GENEL SEKRETER) 

(ÜYE) 

(ÜYE) 

04

ÖNSÖZ 

De¤erli Meslektafllar›m›z, 

Klimik Derne¤i Tüberküloz Çal›flma Grubu olarak düzenledi¤imiz “V.Tüberküloz 

Laboratuvar Tan› Yöntemleri Uygulamal› Kursu”nda sizlerle Diyarbak›r’da bir 

araya gelecek olman›n mutlulu¤unu yafl›yoruz. 

Her geçen gün tan› ve sa¤alt›m›na yönelik önemli geliflmeler kaydedilmifl olmas›na 

karfl›n dünyan›n en önemli sa¤l›k sorunlar›ndan biri olmaya devam eden 

tüberkülozun eradikasyon ve kontrolünde erken tan›, do¤ru sa¤alt›m ve izlemin 

önemli rolü oldu¤u bilinmektedir. Ancak ülkemizde ve dünyada tüberkülozun 

sa¤alt›m ve izleminde oldu¤u kadar pek çok mikobakteriyoloji 

laboratuvar›nda standardizasyon sorunlar› bulunmaktad›r. 

Bu kursun ana hedefi, ülkemizde tan› yöntemlerinde bir standardizasyonun 

sa¤lanmas›na katk›da bulunmakt›r. Kurs için önceden de oldu¤u gibi 16 kat›l›mc› 

kabul edilecek ve 12 kiflilik e¤itici grubu görev yapacakt›r. Her bir kursiyere tüm 

testlerin bizzat yapt›r›ld›¤› uygulamal› kurslara bugüne de¤in ö¤retim üyesi, 

araflt›rma görevlisi ve dispanser hekimi olarak 66 meslektafl›m›z kat›lm›flt›r. 

Kursun ev sahipli¤ini yapan say›n Prof.Dr.Eralp ARIKAN ve çal›flma arkadafllar›na 

teflekkür eder, sayg›lar sunar›z. 

Prof. Dr. Ayfle YÜCE 

Klimik Derne¤i Tüberküloz Çal›flma Grubu Baflkan› 

05

V.TÜBERKÜLOZ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLER‹ 

UYGULAMALI KURS PROGRAMI 

3 Kas›m 2006 

14.30-17.30 Kuramsal program (Uygulama Dersleri ) 

20.00 AKfiAM YEME⁄‹ 

4 Kas›m 2006 

8.30- 12.30 Uygulamal› E¤itim 

12.30- 13.30 Ö⁄LE ARASI 


20.30 AKfiAM YEME⁄‹ 

5 Kas›m 2006 


12.30-13.30 Ö⁄LE ARASI 

13.30-17.30 Uygulamal› E¤itim 

17.30-18.00 KURS DE⁄ERLEND‹RMES‹ VE KAPANIfi 

06

V. TÜBERKÜLOZ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLER‹ 

UYGULAMALI KURSU “KURAMSAL PROGRAM” 

(3 Kas›m 2006) 

Oturum Baflkanlar›: Ayfle YÜCE, Ahmet SAN‹Ç 

14.30-14.50 Klinik materyalin hastadan al›nmas› ve laboratuvara 

gönderilmesi 

Meltem UZUN 

14.50-15.10 Hasta örneklerinin ifllenmesi ve kültürü 

Gülden ERSÖZ 

15.10-15.30 Mikroskopik inceleme teknikleri ve de¤erlendirilmesi 

Ziehl-Neelsen boyama - Nevin SARIGÜZEL SAR 

Auramin-rodamin floresan boyama - Vildan Avkan O⁄UZ 

15.30-15.50 Tüberküloz basilinin identifikasyonu 

Süheyla SÜRÜCÜO⁄LU 

15.50-16.10 Kahve Aras› 

16.10-16.30 Antibiyotik duyarl›l›k test yöntemleri 

Nuri ÖZKÜTÜK 

16.30-16.50 Tüberküloz tan›s›nda PCR 

Ahmet SAN‹Ç 

16.50-17.10 Moleküler tan›da ticari sistemler 

Mustafa ÖZYURT 

17.10-17.30 TARTIfiMA 

07

“UYGULAMALI E⁄‹T‹M KONULARI VE GRUPLARI” 

E⁄‹T‹M GRUP-1 : Hasta örneklerinin ifllenmesi ve kültürü 

a. Hasta örneklerinin ifllenmesi (Homojenizasyon, Dekontaminasyon, 

Konsantrasyon) 

Meltem UZUN 

b. Kültür ( LJ, Middlebrook, Bactec besiyerlerine inokulasyon, 

‹nkübasyon ve De¤erlendirme) 

Gülden ERSÖZ 

E⁄‹T‹M GRUP-2 : Mikroskopik inceleme teknikleri ve de¤erlendirme 

a. Ziehl-Neelsen boyama 

Nevin SARIGÜZEL SAR 

b. Auramin-Rodamin floresan boyama 

Vildan Avkan O⁄UZ, Erdal ÖZBEK 

E⁄‹T‹M GRUP-3 : Klasik identifikasyon yöntemleri 

Üreme h›z›, üreme ›s›s›, pigment yap›m›, mikrokoloni, niasin 

akümülasyonu, nitrat redüksiyonu, NAP testi, Katalaz testi, TCH Testi 

Süheyla SÜRÜCÜO⁄LU, Hörü GAZ‹ 

E⁄‹T‹M GRUP-4 : Antibiyotik duyarl›l›k test yöntemleri 

LJ, Middlebrook 7H10, Bactec460, MGIT 

Nuri ÖZKÜTÜK , Sevim MEfiE 

E⁄‹T‹M GRUP-5 : Tüberküloz tan›s›nda PCR 

Klasik PCR , RFLP 

Ahmet SAN‹Ç, Ahmet K‹Z‹RG‹L 

E⁄‹T‹M GRUP-6: Moleküler tan›da ticari sistemler 

‹zotermal Dizi Yer De¤ifltirme Amplifikasyonu 

(Strand Displacement Amplification - SDA, BD Probe Tec TM ET) 

Mustafa ÖZYURT, Tuncer ÖZEK‹NC‹ 

08

V. TÜBERKÜLOZ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLER‹ 

UYGULAMALI E⁄‹T‹M ROTASYON PROGRAMI 

(4-5 KASIM 2006) 

GÜN 

SAAT 

E T M 

GRUP-1 

E T M 

GRUP-2 

E T M 

GRUP-3 

E T M 

GRUP-4 

E T M 

GRUP-5 

E T M 

GRUP-6 

4 

8.30- 

10.30 

A B C D E F G H 

KASIM 

2006 

10.30-12.30 D A B C E F G H 

13.30-15.30 C D A B G H E F 

15.30-17.30 B C D A G H E F 

GÜN 

SAAT 

E T M 

GRUP-1 

E T M 

GRUP-2 

E T M 

GRUP-3 

E T M 

GRUP-4 

E T M 

GRUP-5 

E T M 

GRUP-6 

5 

8.30- 

10.30 

E F G H A B C D 

KASIM 

2006 

10.30-12.30 H E F G A B C D 

13.30-15.30 G H E F C D A B 

15.30-17.30 F G H E C D A B 

09

TÜBERKÜLOZ LABORATUVARINDA ÇALIfiMA PRENS‹PLER‹ 

Dünya sa¤l›k teflkilat› (WHO)'n›n karar›na göre bir hastaya kesin tüberküloz 

tan›s› konabilmesi için uygun flekilde al›nan klinik örne¤in laboratuvara 

gönderilmesi, ekim yap›lan besiyerlerinde üretilmesi ve tan›mlanmas› gerekir. 

Bu amaçla laboratuvarda görevlendirilecek personel ve çevrenin güvenli¤i için 

afla¤›daki hususlara riayet edilmesi gereklidir. 

Bunlar; 

1. Personelin PPD deri testi bilinmeli, negatif ise BCG afl›s› yap›lmal›d›r. Y›lda bir 

toraks grafisi çekilmeli ve fizik muayenesi yap›lmal›d›r. 

2. Personel tüberküloz hakk›nda bilgilendirilmeli ve laboratuvar kazalar›nda 

yapaca¤› ifllemleri bilmelidir. 

3. Canl› tüberküloz basili ile ilgili tüm ifllemler Class II mikrobiyolojik emniyet 

kabininde yap›lmal›d›r. 

4. Emniyet kabini aç›ld›ktan 15 dakika sonra çal›flmaya bafllanmal›d›r. 

5. Personel koruyucu ekipmanlarla donan›ml› olarak çal›flmal›d›r. 

a. Sadece çal›flma alan›nda kullanabilece¤i koruyucu önlük giymelidir. 

b. Mutlaka eldiven kullanmal›d›r. 

c. Hepa filtreli (N95 standartlar›nda) maske takarak çal›fl›lmal›d›r. 

d. Olas› s›çramalardan korunmak amac› ile gözlük veya yüz sperli¤i 

kullan›lmal›d›r. 

6. Çal›flma alan› gerekti¤inde ve ifllemler tamamland›¤›nda 10-50 kat suland›r›lm›fl 

TSE belgeye sahip sodyum hipoklorid solusyonu ile silinmelidir. 

7. Ayr›ca ifllem sonras›nda ortam ultraviyole ›fl›¤› ile dezenfekte edilmelidir. 

8. Tüberküloz Laboratuvar›n›n enfekte at›klar› otoklavlanarak at›lmal›d›r. 

9. Klinik materyal vortekslendikten sonra 15 dakika dura¤an b›rak›lmal›d›r. 

10. Çal›flma alan›na ancak görevli personel girmeli, personel ç›karken mutlaka 

önlü¤ünü laboratuvarda b›rakmal›d›r. 

11. Çal›flma esnas›nda odan›n kap›s› kapal› olmal›d›r (Negatif bas›nçl› odalar 

önerilir) 

12. M. tuberculosis complex için afla¤›daki durumlarda zaman geçirilmeden 

klinisyene bilgi verilmelidir. 

a. Direkt mikroskopide AARB görülmesinde, 

b. Direkt materyalden moleküler yöntemlerle M. tuberculosis complex’i 

13

tan›mland›¤›nda, 

c. Kültürden üreyen tüberküloz basilinin moleküler veya klasik yöntemlerle 

tan›s› konuldu¤unda, 

d. Antibiyotik duyarl›l›k sonuçlar›n›n belirlenmesi durumunda 

13. Tüberküloz ile ilgili materyal, üzerinde tehlikeli biyolojik materyal iflareti 

bulunan iç-içe geçmifl üç kap sistemi ile gönderilmelidir. 

14

KL‹N‹K MATERYAL‹N HASTADAN ALINMASI VE 

LABORATUVARA GÖNDER‹LMES‹ 

Prof.Dr. Meltem UZUN 

‹stanbul Üniversitesi Çapa T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji 

Anabilim Dal› 

‹nfeksiyon hastal›klar›n›n tan›s›n›n do¤ru yap›labilmesi için uygulanan yöntemlerin 

duyarl›¤›n›n yan›s›ra, incelenecek klinik örneklerin al›nmas›nda ve laboratuvara 

gönderilmesinde belirli kurallara uyulmas› gerekmektedir.Tüberküloz tan›s› için 

de klinik örneklerin al›nma, laboratuvara gönderilme ve ifllenmesinde belirli 

kurallar vard›r. 

Örnek al›nmas› ve laboratuvara ulaflt›r›lmas› ile ilgili genel kurallar: 

• Örnekler temiz, steril, s›zd›rmaz, burgulu kapakl›, dayan›kl› ve tek kullan›ml›k 

kaplar içine yeterli miktarda al›nmal›d›r. Örnek enjektöre al›nacak ve enjektörle 

gönderilecekse luer tipi kapakl› enjektörler kullan›lmal›d›r. 

• Kab›n üzerine örne¤in kimden, ne zaman al›nd›¤› ve örnek tipi yaz›lmal›, 

ayr›ca istek ka¤›d›nda ( veya otomasyon program› olan kurumlarda elektronik 

ortamda) hasta ve örnek ile ilgili gerekli bilgiler belirtilmelidir. 

• ‹lk örnekler antimikrobiyal tedavi bafllamadan önce al›nmal›d›r. 

• Endojen flora ve çevresel kontaminasyonu en aza indirmek için örnekler 

olabildi¤ince aseptik flartlarda al›nmal›d›r. 

• Üremeyi engelleyici herhangi bir koruyucu kimyasal maddeler 

kullan›lmamal›d›r. 

• Kontaminant bakteri ve mantarlar›n üremesinden kaç›nmak için al›nan 

örnekler olas› en k›sa zamanda laboratuvara gönderilmeli ve ifllenmelidir. Bu 

süre bir saati aflacaksa örnek 2-8 °C’de bekletilmelidir (kan hariç). 

Kabul edilmemesi gereken örnekler: 

• Sürüntü örnekleri; 

(Ancak baflka bir flekilde örnek al›nam›yorsa, kurumaya engel olmak için sürüntü 

örnekleri bir transport besiyerine konularak gönderilen örnekler kabul edilebilir) 

• Uygun olmayan kapta gelen örnekler; 

• 24 saatlik, biriktirilmifl örnekler; 

• Dondurulmufl örneklerdeki canl› basil oran› azald›¤›ndan 

Kabul edilmeyen örnekler için yap›lacak ifllemler: 

• Hemen ilgili doktor telefonla aran›r, örne¤in kabul edilemez oldu¤u ve nedeni 

15

aç›klan›r. 

• Örnek ile ilgili bilgilere ek olarak, örne¤in ifllenmeme nedeni, telefonla 

bilgilendirilen kiflinin ad› ve görüflme zaman› not edilir. 

‹fllenmeyen örnekler 2-8˚C ’de 3 gün bekletilir. Tekrar örnek al›namamas› 

durumlar›nda mevcut örnek de¤erlendirilir. 

I. Pulmoner Örnekler : 

Ekspektore veya indüklenmifl balgam, açl›k mide suyu, bronkoalveoler lavaj, 

transtrakeal aspirasyon, bronflial f›rçalama ve laringeal sürüntü örnekleri pulmoner 

örneklerdir . 

Balgam: 

• Birbirini izleyen üç ayr› günde 5-10 ml(miktar› al›nd›¤› kab›n 1/5 ini 

geçmemelidir;örn; 50 ml’lik kaplara en fazla 10 ml) sabah balgam› al›nmas› tercih 

edilir. Ard› ard›na 5-6 günden fazla örnek al›nmas› gereksizdir. 

• Tedavi takibinde, tedavinin bafllamas›ndan 3 hafta sonra ilk kez olmak üzere, 

birer hafta aral›klarla balgam örnekleri al›nmal›d›r. 

• Al›nan balgam örne¤i derin, prodüktif bir öksürükle akci¤erlerden gelen 

koyu, eksüdatif örnek olmal›d›r. 

• Yiyecek art›klar› ve a¤›z floras› ile balgam›n kontamine olmas›n› engellemek 

için balgam ç›karmadan önce hasta a¤z›n› suyla çalkalamal›d›r. 

• Hastaya uygun balgam› nas›l verece¤i, tükürü¤ün ve nasofaringeal 

sekresyonlar›n balgam olmad›¤› anlat›lmal›d›r. 

• Balgam özel bir odada veya aç›k havada ç›kart›lmal›, bu mümkün de¤ilse 

gerekli korunma önlemleri al›nmal›d›r. 

‹ndüklenmifl balgam: 

Hasta balgam ç›karamazsa indüklenmifl balgam örne¤i al›nabilir. Balgam 

indüksiyonu; 

• Steril, ›l›k, aerosolize hipertonik tuzlu su (%10 NaCl) inhalasyonu ile yap›l›r. 

• Bu solüsyon hastaya nebulizatör yard›m› ile 10 dakika kadar derin ve yavafl 

solutulur, sonra derin ve kuvvetli bir öksürük ile balgam al›n›r. 

• Örnek en az 10 ml olmal›d›r. 

‹ndüklenmifl balgam suludur ve tükürü¤e benzer bu nedenle reddedilme riskine 

karfl› indüklenmifl balgam oldu¤u istek ka¤›d›nda belirtilmelidir. 

16

• Musluk suyundaki saprofit mikobakteriler yanl›fl pozitif sonuçlara neden 

olabilece¤inden nebulizatör suyu ile balgam›n kontaminasyonundan kaç›n›lmal›d›r. 

Bronkoalveoler lavaj (BAL): 

• Steril kaplara en az 5 ml. örnek al›nmal›d›r. 

• Kullan›lan bronkoskobun musluk suyu ile kontaminasyonundan kaç›n›lmal›d›r. 

• Kontamine bronkoskop ile bulafl olabilece¤inden bronkoskopun fiziksel 

temizli¤i ve yüksek düzey dezenfeksiyonu önemlidir. 

Bronfliyal f›rçalama: 

Bronfliyal f›rçalama ile elde edilen örnek Middelebrook 7H9 s›v› besiyeri içeren 

steril kaplara konulmal›d›r. 

Transtrakeal aspirat: 

Çok s›k gelen bir örnek de¤ildir. Baz› olgularda yararl› olabilir. Enjektörle veya 

steril kaplara, olabildi¤ince fazla miktarda al›nmal›d›r. 

Açl›k mide suyu (gastrik lavaj s›v›s›): 

Tüberküloz tan›s› için uygun bir örnek de¤ildir ancak; tüberküloz oldu¤u radyolojik 

olarak kan›tlanm›fl balgam› negatif kalan hastalarda,balgam ç›karamayan ya da 

balgam›n› yutan hastalarda,nörolojik hastal›klar veya koma hali nedeniyle 

öksüremeyen hastalarda veya balgam al›m›n›n zor oldu¤u bebek/küçük çocuklarda 

baflka yöntemlerle pulmoner örnek al›nam›yorsa tercih edilebilir. 

Bu s›v›; 

• En az 5-10 ml. olmal› ve birbirini takip eden üç gün boyunca, sabah erken aç 

karn›na al›nmal›d›r. 

• Örnek al›m› hasta uyand›ktan hemen sonra, tercihen yata¤›ndan kalkmadan 

önce yap›lmal›d›r. 

• Örnek dört saat içinde ifllenemeyecekse 100 mg sodyum karbonat bulunan 

steril kaplara al›narak laboratuvara gönderilerilmelidir. 

Larenks sürüntüsü: 

Sürüntü örne¤i, 1 ml kadar serum fizyolojik veya tampon çözeltisi içeren bir kap 

içinde gönderilmelidir. 

17

II. Ekstrapulmoner Örnekler: 

Laboratuvara en s›k gönderilen ekstrapulmoner örnekler idrar, steril vücut s›v›lar› 

ve dokulard›r. Nadir olarak kan ve d›flk› örnekleri de gelebilir. 

‹drar: 

• Birbirini izleyen 3-5 gün süre ile en az 40 ml. olacak flekilde orta ak›m sabah 

ilk idrar› al›n›r. 

• ‹drar verilmeden önce d›fl üro-genital bölgenin temizlenmesi kontaminasyon 

riskini azalt›r. 

• Orta ak›m idrar al›nam›yorsa kateter ile idrar al›nabilir. 

• 24 saatlik biriktirilmifl veya kateter torbas›ndan al›nan idrar kabul edilmemelidir. 

Steril Vücut S›v›lar› (plevral, perikardiyal, peritoneal s›v›lar ve beyin omurilik 

s›v›s›): 

• Miktar› mümkün oldu¤unca fazla olmal›(mümkünse 50 ml) ve 10-15 mililitreden 

az olmamal›d›r (BOS için en az 2 ml). Miktar daha az ise direkt olarak Bactec 13A 

fliflesine veya di¤er bir s›v› besiyerine (Middlebrook 7H9, Dubos tween albümin) 

ekilebilir. 

• Bu s›v›lar›n ço¤u fibrinojen içerebilece¤inden toplama kab›na antikoagülan 

olarak sodyum poliyanetol sülfonat (SPS) veya heparin eklemek gerekebilir. 

Abse örnekleri ve Aspirasyon s›v›lar›: 

Örnek al›m›ndan önce alkol ile cilt temizli¤i yap›larak, mümkün oldu¤unca çok 

miktarda örnek enjektör ile aspire edilmelidir. Küçük miktarlardaki aspirasyon 

s›v›lar›n›n tafl›nmas› için Middlebrook 7H9 s›v› besiyeri kullan›labilir. Aspirasyon 

için hacim yeterli olmad›¤› durumlarda sürüntü al›nabilir. Sürüntü örneklerinden 

elde edilen negatif sonuçlar›n güvenilir olmad›¤› rapor edilmelidir. 

Doku örnekleri (lenf nodu, deri ve di¤er biyopsi örnekleri): 

• En az 1 gram doku parças›, mümkünse aseptik flartlarda steril kaplar içine 

al›nmal›d›r.Çok küçük miktarda biopsi örne¤i al›nm›flsa mutlaka serum fizyolojik 

içine koyulmal›d›r. Al›nan örnek gazl› beze sar›lmamal›d›r. 

• Lezyonun kazeöz k›s›m› seçilmeli ve deri ülserlerinde lezyonun periferinden 

biyopsi al›nmal›d›r. 

• Formalin içinde gönderilen örnekler kabul edilmemelidir. 

18

Kan: 

• Aseptik koflullarda al›nan kan örne¤i direkt olarak hasta bafl›nda 10 ml’lik 

isolatör tüpe veya Bactec 13A fliflesine ve bu amaçla kullan›lan di¤er kan kültür 

fliflelerine 5 ml.olacak flekilde aktar›l›r. 

• Hasta bafl›nda ekim yap›lamad›¤› durumlarda 10 ml kan SPS veya heparin 

içeren steril tüplere al›n›r. 

• EDTA (etilendiamintetraasetik asit)’l› tüplere toplanan kanlar ve koagüle 

kanlar kabul edilmez. 

D›flk›: 

• En az 1 gr d›flk› örne¤i steril, tek kullan›ml›k, parafin içermeyen bir kap içine 

al›n›r. 

• A‹DS hastalar›n›n d›flk›lar›ndan Mycobacterium avium complex (MAC) s›kl›kla 

üretilebilir.Ancak bu hastalar için rutin inceleme önerilmez. 

Örneklerin Gönderilmesi: 

Dünya sa¤l›k örgütü (DSÖ), CDC (Centers for Disease Control and Prevention) ve 

uluslararas› yasal düzenlemeler klinik örneklerin ve mikobakteri kültürlerinin 

postalanmas›nda üçlü kap sistemini zorunlu k›lmaktad›r.Mikobakteri kültürlerinin 

postalanmas›nda burgulu kapakl› tüplerdeki kat› besiyerine pasaj yap›lmal›, petri 

kutusu veya s›v› besiyeri kullan›lmamal›d›r. (Resim 1) 

Birincil kap (primer kap): materyalin kondu¤u, cam veya plastikten yap›lm›fl 

burgulu kapakl›,s›zd›rmaz, flok ve bas›nç de¤iflikliklerine dirençli kaplard›r. 

Kapaklar ayr›ca bir bant veya benzer materyal ile sar›labilir. Örne¤i tan›mlay›c› 

bilgi veya numara kab›n üzerine yaz›lmal›d›r. 

‹kincil kap (sekonder kap): Bir veya daha fazla birincil kab›n konuldu¤u 

s›zd›rmaz, dayan›kl› bir kapt›r. ‹kincil kap ile birincil kap aras›ndaki bofllu¤a (alt, 

üst ve yanlar) herhangi bir s›zma durumunda tüm içeri¤i emebilecek ve birincil 

kaplar›n birbiriyle temas›n› engelleyecek kuvvetli bir emici madde (bez, pamuk) 

yerlefltirilmelidir. ‹kincil kap üzerine göndericinin ad›, adresi ve telefon numaras› 

yaz›lmal›d›r. 

D›fl kap (postalama kab›): ‹kincil kab›n konuldu¤u, dayan›kl›, sert bir 

malzemeden yap›lm›fl (tahta, oluklu mukavva, sert plastik, vs.) kapt›r. Kab›n içine 

ikincil kap ile beraber içeri¤in ayr›nt›l› listesi de konulmal›d›r. Kuru buz 

19

kullan›lacaksa bunlar ikincil kap ile d›fl kap aras›na konulmal› ve kuru buz 

buharlaflt›¤›nda ikincil kab›n orijinal pozisyonu bozulmayacak flekilde desteklenmeli, 

buz kullan›lacaksa su s›zd›rmaz flekilde olmal›d›r. D›fl kap üzerine gönderici ve 

al›c›n›n ad›, adresi, telefon numaras› yaz›lmal›, enfeksiyöz (bulafl›c›) madde yaz›s› 

ve biyolojik tehlike (biohazard) etiketi yap›flt›r›lmal›d›r. 

Resim 1: ‹nfeksiyöz maddelerin paketlenmesi ve etiketlenmesi (CDC’den) 

KAYNAKLAR: 

1 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) HHS 

Publication (CDC), 4th Edition. May 1999. 

2 Dunlap NE, Bass J, Fuj›wara P, et all. Diagnostic Standards and Classification 

of Tuberculosis in Adults and Children. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 

1376–1395. 

3 Forbes BA,, Sahm DF, Wissfeld AS. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 

10th. Ed. St.louse, Missouri: Mosby-Year Book. 2002:547-8. 

4 WHO. Guidelines for the Safe Transport of Infectious Substances and Diagnostic 

Specimens WHO/EMC/97.3. 

5 Kent PT, Kubica GP. Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level 

III Laboratory. Atlanta: HHS Publication (CDC),. 1985: 21-30. 

6 Winn WC, , Allen SD, Janda WM, Koneman EW, Procop GW, Schreckenberger 

PC, Woods GL.Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 

6th. Ed. Philadelphia, Newyork: Lippincott Williams&Wilkins. 2006:1064-11244. 

7 Master RN. Mycobacteriology. In: Isenberg HD (ed.). Clinical Microbiology 

Procedures Handbook. Washington DC: ASM, 1992: 3.2.1-6. 

20

8 Pfyffer GE, Brown-Elliot BA, Wallace RJ. Mycobacterium: General characteristics, 

isolation and staining procedures. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover 

FC, Yolken RH eds. Manual of Clinical Microbiology, 8th ed. Washington DC: 

ASM; 2003:532-59. 

9 CDC. Packaging, Labeling and Shipping Infectious Substances. Public Healt 

Practice Program Office, CDC (www.phppo.cdc.gov/nltn/pdf/2000/3.0/shipdoc4.pdf) 

10 Strong BE, Kubica GP. Isolation and identification of Mycobacterium tuberculosis: 

A Guide for the Level II Laboratory. Atlanta: HHS Publication (CDC), 

1979:35-42. 

21

ÖRNEKLER‹N ‹fiLEMLENMES‹ VE KÜLTÜR YÖNTEMLER‹ 

Doç.Dr. Gülden ERSÖZ 

M.Ü T›p Fakültesi, ‹nfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji AB Dal›, Mersin 

Tüberküloz etkeni bakterilerin izolasyonu için klinik örneklere lökosit, eritrosit, 

vücut s›v›lar› ve doku gibi organik kal›nt›lardan ar›nd›rmak amac› ile 

homojenizasyon/dekontaminasyon ve örnekteki bakteri yo¤unlu¤unu art›rmak 

için konsantrasyon ifllemi uygulan›r. 

Homojenizasyon-dekontaminasyon-konsantrasyon iflleminde en s›k N-Asetil- 

L-Sistein (NALC) + Sodyum hidroksit (NaOH) ve NaOH (%3-4) gibi yöntemler 

kullan›lmakla birlikte; zefiran-trisodyum fosfat, oksalik asit, setilpridinyum kloridsodyum 

klorid gibi farkl› yöntemlerden de yararlan›labilir. 

N-Asetil-L-Sistein(NALC)+Sodyum hidroksit(NaOH) yöntemi 

NALC mukolitik, NaOH dekontaminan ve sodyum sitrat klinik örnekte 

bulunabilecek a¤›r metal iyonlar›n› ba¤layarak NALC’›n inaktive olmas›n› önlemek 

amac›yla kullan›l›r. 

NALC-NaOH solusyonunun haz›rlanmas›: 

% 4 NaOH + % 2.9 Sodyum sitrat + NALC 

50 ml 50 ml 0.5 gr 

NALC oksijene duyarl› oldu¤u için bu kar›fl›m haz›rland›ktan sonra 24 saat içinde 

kullan›lmal›d›r. NALC’ ›n tart›m ifllemleri s›ras›nda ambalaj›n a¤z› uzun süre aç›k 

b›rak›lmamal›d›r. 

22

Yöntem: 

• Klinik örnek 50 ml’lik polipropilen, dibi konik, burgulu kapakl› steril tüplere 

(Falkon tüpü) aktar›l›r ve üzerine klinik örne¤in miktar› kadar NALC-NaOH 

solüsyonu ilave edilir. Örnek 10 ml’den fazla ise en pürülan, mukoid ve kanl› 

k›sm›ndan 10 ml al›nmal›d›r. Mukoid olmayan örnekler santrifüjde çevrildikten 

sonra elde edilen sediment dekontamine edilir. 

• Örnek + NALC-NaOH kar›fl›m›n› içeren tüpler 30 saniyeyi geçmeyecek flekilde 

vortekslenir. Tüpler oda ›s›s›nda ara s›ra elle çalkanarak 15 dakika bekletilir. Bu 

süre afl›lmamal›d›r. 

• Dekontaminasyon ifllemini takiben yap›lacak her ifllemde asepsi-antisepsi 

kurallar›na uyulmal›d›r. 

• Süre tamamland›¤›nda nötralizasyon amac› ile Falkon tüpünün 50 ml – 

iflaretine kadar 0,067 M fosfat tamponu (pH 6.8) ilave edilip, kar›fl›m el yard›m› 

ile alt-üst edilir ve dekontaminasyon ifllemi durdurulur. 

• Fosfat tamponu ilave edilmifl tüpler, bakteri yo¤unlu¤unu art›rmak için 3000 

x g’de 15-20 dakika santrifüj edilir. 

• Süpernatant, içinde 1/10-1/50 dilüe edilmifl sodyum hipoklorid bulunan bir 

kaba boflalt›l›r. 

• Sedimente 1-2 ml steril fosfat tamponu (pH 6.8) veya % 0.2’lik s›¤›r albumin 

fraksiyon V ilave edilir. 

• Resüspanse ifllemi uygulan›r ve kullan›lan kültür yöntemine uygun olarak 

besiyerine ekilir. 

• Ayr›ca direkt mikroskopik inceleme için lam üzerine yayma ifllemi yap›l›r. 

Normalde steril oldu¤u düflünülen BOS, vücut s›v›lar› ve kan gibi örneklere 

dekontaminasyon ifllemi uygulanmaz. Bu örnekler santrifüj edildikten sonra 

besiyerlerine ekimleri yap›l›r. Ancak örnek al›m› ve transportu esnas›nda asepsiantisepsi 

kurallar›na uyulmam›fl ise bu örneklere de dekontaminasyon ifllemi 

uygulan›r. 

KÜLTÜR YÖNTEMLER‹ 

M.tuberculosis complex, uygun s›v› ve kat› besiyerlerinde 35-37OC’de, 7-21 

günde ürerler. Kültürler 8 haftaya kadar ürememifllerse negatif sonuç verilir. 

Mikobakterilerin izole edilmeleri ve çeflitli özelliklerinin incelenmesi amac›yla 

23

kullan›lan konvansiyonel besiyerleri kat› ve s›v› olmak üzere iki tiptir. Kat› 

özellikteki besiyerleri, yumurta bazl› ve agar bazl› olmak üzere iki bölümde 

incelenir. Özellikle primer izolasyonda Löwenstein-Jensen (L-J) besiyerinin kullan›m› 

yayg›nd›r. Petragnani ve American Thoracic Society di¤er yumurta bazl› 

besiyerleridir. Agar bazl› besiyerleri 10-12 gün sonra mikroskop alt›nda 

incelendi¤inde koloniler gözlenebilir. Middlebrook 7H10 ve Middlebrook 7H11 

en çok tercih edilen agar temelli besiyerleridir. L-J Gruft, Mycobactosel L-J, 

Mycobactosel Middlebrook 7H10, Mitchison’s selektif 7H 11 antibiyotik ve 

antifungal içermeleri nedeniyle kontaminasyon daha az s›kl›kta gözlenir. E¤er 

iki kat› besiyeri kullan›lacaksa besiyerlerinden birinin selektif olmas› önerilir. 

KÜLTÜR ‹fiLEM‹ 

• Homojenizasyon- dekontaminasyon- konsantrasyon sonras› elde edilen 

sediment steril bir pipet yard›m› ile al›narak 3 damla kadar L-J besiyerine ekilir 

ve besiyeri yüzeyine yay›lmas› sa¤lan›r. Ekim yap›lan besiyerleri kapaklar› 

gevfletilerek 1-5 gün (biriken s›v› kaybolana kadar) yat›k konumda bekletilir. 

• Middlebrook 7H10 ve/veya 7H11gibi agar temelli besiyerleri kullan›l›yorsa, 

1 damla sediment besiyeri yüzeyine iyice yay›l›r ve her besiyeri CO2 geçiren plastik 

torbalara yerlefltirilir. 

• H›zl› kültür sistemlerine ekim firma önerileri do¤rultusunda yap›l›r. 

• M.marinum ve M.ulcerans ile infekte oldu¤u düflünülen deri ve yumuflak 

doku örneklerinden izolasyon için 30˚C’de, M.haemophilum ile infekte oldu¤u 

düflünülen klinik örnekler özel besiyerine ekilir ve 35-37˚C’de inkübe edilir. 

• Ekim yap›lan besiyerleri inkübasyondan 3-5 gün sonra ve takiben haftada bir 

kez kontrollerine devam edilir. 

• Petrideki agar bazl› besiyerleri parafilm ile kapat›larak inkübe edilir ve ters 

çevrilerek mikroskop alt›nda mikrokoloniler oluflumu ve morfolojik yap›s› incelenir. 

• Besiyerlerinde üreyen koloniler aside dirençli boyama yöntemlerinden biri 

ile incelenir. 

• AARB pozitif olan izolatlar›n tür tan›s› yap›l›r. 

S›v› besiyerleri içinde yer alan Middlebrook 7H9 ve Dubos tween albumin, 

mikobakterilerin stok sufllar›n›n subkültürlerinin yap›lmas›nda, duyarl›k deneylerive 

di¤er in vitro deneylerde inokulum haz›rlanmas› amac›yla da kullan›l›r. Middlebrook 

24

7H9 s›v› besiyeri genellikle h›zl› kültür sistemlerinde temel besiyeri olarak 

kullan›lmaktad›r. Primer izolasyon amac›yla kat› besiyerine ilave olarak s›v› 

besiyerlerinin kullan›lmas› önerilmektedir. 

Özel besiyerlerine inokulasyon ve inkübasyon; 

H›zl› kültür sistemleri içinde yer alan yar› otomatize Bactec 460 TB (Becton 

Dickinson Diagnostic Instruments, Sparks,MD) sistemi, izolasyon, identifikasyon 

ve duyarl›l›k deneylerinin uyguland›¤› bir sistem olarak uzun y›llard›r rutin tan›da 

kullan›lmaktad›r. Radyometrik kültür tekni¤i ile mikobakteri üretici besiyerine 

de¤eri ölçülebilen substrat olarak radyoaktif karbon (14C) eklenir. Bu substrat 

mikobakteri taraf›ndan utilize edilir ve metabolizma s›ras›nda 14CO2 oluflur. 

BACTEC 460 ile radyoaktivite kantitatif olarak ölçülür. Antimikrobiyal olarak 

kullan›lan PANTA (Polimiksim B-6000U/ml, Amfoterasin B-600g/ml, Nalidixik asit 

2400g/ml, Trimetoprim laktat-600g/ml, Azlosilin 600g/ml) eklenir. Kontamine 

olmad›¤› düflünülen akci¤er d›fl› örnekler bekletilmeden ekiliyorsa PANTA 

eklenmeyebilir. 

Örnekler i¤ne ucu ç›kmayan tüberkülin enjektörüyle PANTA ekllenmifl 12B 

besiyerine 0.1-0.5 ml ekilir. ‹nkübasyon; 37oC’de yap›l›r ve de¤erlendirme 

yo¤unlu¤u fazla olmayan merkezlerde ilk 2-3 hafta haftada 3 defa yo¤unlu¤u 

fazla merkezlerde ise ilk iki hafta iki sonra alt› hafta boyunca haftada bir defa 

BACTEC 460 okuma cihaz› ile yap›l›r. Üreme indeksi (GI) 10 alt›nda ise negatif, 

10 ise pozitif kabul edilir. ‹ndeks 100’ün üzerine ç›k›nca ARB boyama yap›larak 

mikobakteri olup olmad›¤› do¤rulan›r. 

MGIT (mycobacteria growt indicator tube); besiyeri olarak Middlebrook 7H9 

broth kullan›l›r. OADC (oleic asid-albumin-dextroz-katalaz) ile zenginlefltirilmifltir. 

Antimikrobiyal olarak PANTA kullan›l›r. ‹drar ve kan hariç bütün örneklerin 

inkübasyonu için kullan›l›r. MGIT tüpleri de BACTEC’le ayn› s›kl›kta de¤erlendirilir. 

UV ›fl›¤› ile hem tüp alt›nda hem de s›v› besiyerinin üstünde çizgi fleklinde turuncu 

›fl›klanma kontrol edilir. Bactec Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT) 

960 (BD Biosciences,Sparks,MD)inkübatörü ile tam otomize bir sistemdir. 

VersaTREK (ESP Culture System - Trek Diagnostics,Inc.,Westlake Ohio), MB/Bact 

T (bioMerieux, Hazelwood, Mo.), Bactec 9000 MB (BD Biosciences,Sparks,MD) 

mikobakterilerin tan›s› için gelifltirilmifl tam otomatize sistemlerdir. Ancak 

bunlardan Bactec 460 TB ve MGIT 960 için FDA onay› bulunmaktad›r. Üreme 

süresi, oran› ve kontaminasyon s›kl›¤› aç›s›ndan tam otomatize sistemler aras›nda 

önemli bir fark bulunamamaktad›r. 

25

KAYNAKLAR 

1. Benjamin WH, Waites KB, Moser SA. The MB/Bac T is a sensitive method of 

isolating Mycobacterium tuberculosis from clinical specimens in a laboratory with 

a low rate of isolation. J Clin Microbiol 2000; 38: 3133-4. 

2. Della-Latta P.,Weitzman I.Mycobacteriology. In: Isenberg HD (ed). Essential 

Procedures for Clinical Microbiology. Washington DC: ASM Press.1998: 169-75,175- 

83. 

3. Della-Latta P. Digestion-decontamination procedures.In: Isenberg HD 

(ed).Clinical Microbiology Procedure Handbook.Vol 2, 2nd ed. Washington 

DC:ASM Pres.2004: 7.1.2.1 

4. Lillian VL.Solid media for isolation. In: Isenberg HD (ed).Clinical Microbiology 

Procedure Handbook.Vol 2, 2nd ed. Washington DC:ASM Pres.2004: 7.3.1 

5. Drancourt M, Carrieri P, Gevaudan MJ, Raoult D. Blood agar and Mycobacterium 

tuberculosis: the end of a dogma. J Clin Microbiol 2003; 41: 1710-11. 

6. Drobniewski FA, Caws M, Gibson A, Young D. Modern laboratory diagnosis 

of tuberculosis. The Lancet Infect Dis 2003; 3: 141-7. 

7. Manterola JM, Thornton CG, Padilla E, Lonca J, Corea I, Martinez E, Ausina 

V. Comparison of the sodium dodecyl sulfate-sodium hydroxide specimen 

processing method with the C18-Carboxypropylbetaine specimen processing 

method using the MB/Bac T liquid culture system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 

2003; 22: 35-42. 

8. Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ. Mycobacterium In: Murray PR, Baron EJ, 

Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology, 7th 

ed. Washington DC: ASM Press. 1999: 399-437. 

9. Somoskovi A, Ködmön C, Lantos A, Partfai Z, Tamasi L, Füzy J, Magyar P. 

Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated 

Bactec MGIT 960 system, the Bactec 460 TB system, and Löwestein-Jensen medium. 

J Clin Microbiol 2000; 38: 2395-7. 

10. Strong BE,Kubica GP. Isolation and Identification of Mycobacterium 

tuberculosis. A guide for the level 2 laboratory.Centers for Disease Control. 

Atlanta ,HHS Publication no.(CDC) 81-8390. 

11. Whyte T, Hanahoe B, Collins T, Corbett-Feeney G, Cormican M. Evaluation 

of the Bactec MGIT 960 and MB/Bac T systems for routine detection of 

Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2000; 38: 3131-2. 

12. Williams-Bouyer N, Yorke R, Lee HI, Woods GL. Comparison of the Bactec 

MGIT 960 and ESP Culture system II for growth and detection of mycobacteria. 

J Clin Microbiol 2000; 38: 4167-70. 

13. Woods GL. The mycobacteriology laboratory and new diagnostic techniques. 

Infect Dis Clin North Amer 2002; 16: 127-44. 

26

D‹REK M‹KROSKOP‹ TEKN‹KLER‹ VE DE⁄ERLEND‹R‹LMES‹ 

Dr. Nevin SARIGÜZEL SAR 

Üsküdar Devlet Hastanesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, 

‹stanbul 

Mikobakteriler için bafll›ca iki boyama tekni¤i gelifltirilmifltir: 

1. Karbol fuksin yöntemi (Ziehl- Neelsen, Kinyoun): Aside dirençli 

mikroorganizmalar ›fl›k mikroskobunda k›rm›z› renkte görülür. 

2. Florokrom yöntemi (auramin O, auramin-rhodamin): Aside dirençli 

mikroorganizmalar florasan mikroskopta sar›ms› - turuncu renkte floresan verirler. 

Aside dirençli boyama mikobakterilerin lipidden zengin hücre duvarlar›n›n primer 

boya ile boyanmas› ve renk giderici ajan asit ve alkolle muameleden sonra boyal› 

kalmas› esas›na dayanmaktad›r. Bu nedenle mikroorganizma aside dirençli basil 

(ARB) olarak adland›r›l›r. 

Direk mikroskopi ile görülebilmesi için, balgam›n her ml’ sinde 5000-10000 

basil bulunmas› gereklidir. Direkt mikroskopik incelemenin duyarl›l›¤› % 22-80 

aras›nda de¤iflkenlik gösterir. 

Duyarl›l›¤› etkileyen faktörler; 

• Örne¤in tipi, 

• Enfekte eden mikobakteri türü, 

• Dekontaminasyon ve kontaminasyon iflleminin etkisi, 

• Boyama tipi, 

• Yayman›n kal›nl›¤›, 

• Yaymay› inceleyen laboratuvar personelinin deneyimi. 

Yayman›n Haz›rlanmas›: Lam›n k›r›lmas›, boya baflar›s›zl›¤› gibi problemler 

veya düflük miktarda organizma içeren pozitiflikleri do¤rulamak için en az iki 

yayma haz›rlanmas› gereklidir. 

A. BOS d›fl› klinik örnekler : 

• Etanol ile temizlenmifl çiziksiz her lama hasta protokol no’su yaz›l›r. 

• Yayma ifllemi öncesi örnekler iyice vortekslenir. 

27

• Örnek öze veya pipet kullan›larak lama transfer edilir. ‹fllem görmemifl 

örneklere ait preparat haz›rlamak için kanl›, mukoid ve nekrotik k›s›m kullan›l›r. 

• Örnek lam üzerine orta bölümde oval tarzda yay›l›r. Yo¤un materyalden 

preparat haz›rland›¤› durumlarda; bir lam üzerine al›nan materyal, ikinci bir lam 

ile bast›r›l›r ve iki lam aras›nda yay›l›m› sa¤layacak flekilde z›t yönde çekilir. 

• Öze yeniden kullan›lmadan önce iyice alevden geçirilir. 

• Pipetler kullan›m sonras›nda dezenfektana veya t›bbi at›k kab›na b›rak›l›r. 

• Preperatlar›n biyolojik güvenlik kabininde kurutulmas› önerilir. 

• Yayma preparatlar afla¤›daki yöntemlerden biri ile lama tespit edilir. 

a) Elektrikli lam ›s›t›c›s› (65-70°C)’ nda en az 2 saat süreyle bekletilir. Gece boyunca 

kalmas› kabul edilebilir. 

b) Lamlar, bek’in mavi alevinden 3 veya 4 kez geçirilir, fazla ›s›t›lmaz. 

c) Lamlar saf metanolde 1 dakika süreyle bekletilir. 

Not: Is› ile tespit, tüm mikobakterileri öldüremeyebilir. Bu nedenle lamlar›n 

bulaflt›r›c› olabilece¤i unutulmamal› ve incelemeyi takibeni t›bbi at›k 

kaplar›na at›lmal›d›r. 

B. BOS örnekleri: 

• BOS sedimenti vortekslenir 

• Steril pastör pipeti ile lam›n merkezine damlat›l›r. 

• Preparat havada kurutulur. 

• Damlatma ifllemi iki kez daha tekrarlan›r, her defas›nda yeni damla do¤rudan 

önceki damlan›n üzerine damlat›l›r. 

• Daha önceden tan›mlanan yöntemlerden biri ile tespit edilir. 

A. KARBOL FUKS‹N BOYAMA 

1. Ziehl-Neelsen karbol fuksin 

a) Solüsyon 1. 10 ml % 95 etanolde 0.3 g bazik fuksin çözülür. 

b) Solüsyon 2. 100 ml distile suda 5.0 g fenol kristalleri çözülür (hafif ›s›tma 

gerekebilir). 

Çal›flma solüsyonu : Solüsyon 2’ nin 90 ml’si solüsyon 1’ile 100 ml’ ye tamamlan›r. 

2. Kinyoun’un karbol fuksin 

a) Solüsyon 1 : 20 ml % 95 etanolde 4.0 g bazik fuksin çözülür. 

b) Solüsyon 2 : 100 ml distile suda 8.0 g fenol kristalleri çözülür. Is›tmak gereklidir. 

28

Çal›flma solüsyonu : Solüsyon 1 ve 2’nin tamam› birlefltirilir. 

B. RENK G‹DER‹C‹ AJAN 

% 3 asid - alkol 

3 ml konsantre hidroklorik asidi, 97 ml % 95 etanol’e dikkatlice eklenir. 

C. ZIT BOYA 

Metilen mavisi veya brilliant yeflili z›t boya olarak kullan›labilir. 

1) Metilen mavisi : 100 ml distile suda 0.3 g methylen blue chlorid’i çözülür. 

2) Brilliant yeflili : 100 ml distile suda 1.0 g brilliant green çözülür. 

NOT: Haz›rlanan boya ve solusyonlar›n ad›, haz›rlama ve son kullanma tarihi 

flifle üzerine etiketlenir. Haz›rlanan solusyonlar 3 aydan sonra kullan›lmamal›d›r. 

KAL‹TE KONTROL 

Her boyama iflleminde negatif ve pozitif kontrol çal›fl›lmal›d›r. 

Kalite kontrol yaymalar› afla¤›daki flekilde haz›rlan›r. 

• Escherichia coli (negatif kontrol) ve Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC 

25177 (pozitif kontrol) sufllar›, 1.0 ml fizyolojik tuzlu su veya steril distile suda 

ayr› ayr› No.1 Mc Farland bulan›kl›k standard›nda ve biyolojik güvenlik kabininde 

süspansiyonlar› haz›rlan›r. 

Not: Mycobacterium kansasii gibi daha az patojenik organizmalar pozitif 

kontrol amaçl› kullan›labilir. Ancak h›zl› üreyen mikobakteriler’in aside dirençli 

boyalar› tutmalar› de¤iflkenlik gösterdi¤inden kullan›lmazlar. 

• Kontrol lamlar etiketlenir. Üzerine haz›rlama tarihi ve haz›rlayan›n ad› 

kaydedilir. 

• Negatif kontrol süspansiyonundan tek kullan›ml›k bir pipetle lam›n ucuna 

yak›n bir damla damlat›l›r. 

• Pozitif kontrol süspansiyonu ile üçüncü basamak tekrarlan›r, damla negatif 

kontrol ve lam etiketi aras›na damlat›l›r. 

• Yaymalar tercihen biyolojik güvenlik kabininde havada kurutulur ve tespit 

edilir 

• Lamlar etiketli lam kutusunda saklan›r. 

Kontrol lamlar ticari olarak temin edilebilir. 

29

DE⁄ERLEND‹RME: 

I. Hasta yaymalar› okunmadan önce kontrol lamlar› de¤erlendirilir. 

Karbol fuksin (Ziehl-Neelsen veya Kinyoun): 

1) Mycobacterium spp.: Kullan›lan z›t boyaya ba¤l› olarak mavi veya yeflil zeminde 

k›rm›z› renkte, 

2) N.asteriodes veya E.coli: Kullan›lan z›t boyaya ba¤l› olarak mavi veya yeflil 

renkte görülür. 

II. Kontrol lam›n sonuçlar› kaydedilir. Sonuçlar kabul edilebilirse hasta yaymalar› 

incelenir. Kontrol lam› uygun de¤ilse, boyalar›n haz›rlanmas› ve ifllemleri yeniden 

gözden geçirilir. 

De¤erlendirme sonucu kabul edilemez kontrol lamlar› flunlard›r: 

1) Pozitif kontrolde basiller k›rm›z› renkte görülmüyorsa 

2) Negatif kontrolde basiller k›rm›z› renkte görülüyorsa. 

3) Zemin gere¤i flekilde dekolorize olmam›flsa. 

Problem ortaya ç›kt›¤› zaman tüm hasta lamlar› ve bir kontrol lam yeniden 

boyan›r. 

BOYAMA ‹fiLEMLER‹ 

A. Z‹EHL-NEELSEN ( SICAK KARBOL FUKS‹N) BOYAMA: 

• Tüm lam karbol fuksin boya ile kaplan›r. 

• Bek veya elektrikli boyama raf› kullanarak buhar ç›kacak kadar (sigara duman› 

tarz›nda) lam alttan yavaflça ›s›t›l›r. 

• Düflük ›s›yla veya aral›kl› ›s› kullanarak 3-5 dakika süreyle buharlaflmas› devam 

ettirilir. 

• Lam so¤umaya b›rak›l›r ve takiben su ile y›kan›r. 

• % 3 asit-alkolle lam kaplan›r ve renk akmay›ncaya kadar renk giderme ifllemi 

uygulan›r. 

• Lam su ile iyice y›kan›r, fazla su lamdan ak›t›l›r. 

• Lam üzerine z›t boya (metilen mavisi veya brilliant yeflili) ilave edilir ve 20- 

30 saniye boyan›r. 

• Çeflme alt›nda su ile iyice y›kan›r ve fazla su lamdan ak›t›l›r. 

• Yayma havada kurutulur. (Kurutma ka¤›d› kullan›lmamal›d›r). 

• Preparat 100‘lük immersiyon objektifi ile incelenir. 

30

B. K‹NYOUN KARBOL FUKS‹N (SO⁄UK KARBOL FUKS‹N) BOYAMA: 

• Tüm preparat karbol fuksin ile kaplan›r. 

• Yayma 2 dakika süreyle boyan›r. 

• Lam suyla y›kan›r. 

• Lam % 3 asit-alkolle kaplan›r ve renksizlefltirme ifllemi yap›l›r. 

• Su ile y›kan›r ve fazla su lamdan ak›t›l›r. 

• Lam z›t boya ile ( metilen mavisi veya brilliant yeflili) kaplan›r. 

• Z›t boya ile 20-30 saniye boyan›r. 

• Su ile iyice y›kan›r, fazla su lamdan ak›t›l›r. 

• Yayma havada kurutulur. Kurutma ka¤›d› kullan›lmaz. 

• Preparat 100’lük immersiyon objektifi ile incelenir 

YAYMANIN ‹NCELENMES‹ 

A. ‹nceleme Yöntemi: 

• Aside dirençli basilin varl›¤› için, her yayma en az 15 dakika süre ile incelenir. 

• Yaymay› negatif olarak raporlamadan önce karbolfuksin boyama ile minimum 

300 alan incelenmelidir. 

• Yayman›n uzun kenar› boyunca 3, k›sa kenar› boyunca 9 paralel tarama 

yap›lmal›d›r. Bu hem genifl bir okuma alan› sa¤lar, hem de ayn› bölgenin birden 

fazla okunmas› olas›l›¤›n› uzaklaflt›r›r. 

MORFOLOJ‹K ÖZELL‹KLER: 

• Aside dirençli basil yaklafl›k olarak 1-10 μm uzunlu¤unda ve tipik olarak 

k›rm›z›, ince, tekli veya demetler halinde çomak fleklinde görülür. 

• Bakteri, boncuk dizisi tarz›nda boyanma bölgeleri gösterebilir. 

• M. tuberculosis d›fl›nda baz› mikobakteriler pleomorfik görünebilir, uzun 

basillerden kokoid formlara kadar de¤iflmektedir. 

SONUÇLARI RAPOR ETME: 

Boyama sonuçlar› 24 saat içinde klinisyene bildirilmelidir. 

ARB negatif : Aside dirençli basilin görülmedi¤i tüm yaymalar “ Aside dirençli 

basil görülmedi ‘’ fleklinde raporlan›r. Negatif raporlanan yaymalar kültür rapor 

edilinceye kadar saklanmal›d›r. 

31

ARB pozitif : Bir yaymada aside dirençli basil görüldü¤ü zaman, “Aside dirençli 

basil görüldü ’’ fleklinde rapor edilir. Boyanma yöntemi belirtilerek yaymada 

gözlenen basil say›s›na göre skorlama yap›l›r. 

Al›fl›lmad›k s›kl›kta yayma pozitif (kültür negatif) sonuç ile karfl›lafl›l›r ise, 

yanl›fl pozitiflik nedenleri araflt›r›lmal›d›r. 

• Su, su tanklar› ve boyalar aside dirençli mikroorganizmalarla kontamine 

olabilir. 

• Boyama ifllemi süresince materyalin lamdan lama transferi oluflabilir. 

• ‹mmersiyon objektifi için kullan›lan ya¤ ile aside dirençli organizmalar›n 

transferi oluflabilir. Pozitif bir yaymadan sonra lens mutlaka temizlenmelidir. 

ARB boyama: 

A. Mikobakteriden baflka Rhodococcus spp., Legionella micdadei, Cryptosporidium 

spp.’nin kistleri ve Isospora spp. gibi baz› mikroorganizmalar›n ARB boyanabildi¤i 

dikkate al›nmal›d›r. 

B. H›zl› üreyen mikobakteriler boyanmada de¤iflkenlik gösterebilirler. 

C. Pozitif yayma preparatlar› bir baflka uzman taraf›ndan da do¤rulanmal›d›r. 

32

KAYNAKLAR 

1. Nolte FS, and Metchbock B. Mycobacterium. In Murray PR, Baron E Jo, Pfaller 

MA, Tenover FC, Yolken RH (ed). Manual of clinical microbiology. Sixth edition. 

ASM Press, Washington DC. 1995; 400- 437. 

2. Brown BA, Swenson JM, Wallace RJ, Jr. Acid- fast Stain Procedures. In Isenberg 

HD, (ed). Clinical microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington 

DC, 1992; p.3.5.1- 3.5.11. 

3. Dunlap NE, Bass J, Fujiwara P, Hopewell P, Hersburg CR, Salfinger M, Simone 

PM. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. 

Am J Respir Crit Care Med, 2000; 161: 1376- 1395. 

4. Somoskövi A, Hotaling JE, Fitzgerald M, O’Donnell D, Parsons LM, Salfinger 

M. Lessons from a proficiency testing event for acid- Fast microscopy. Chest 2001; 

120: 250- 257. 

5. Woods GL. The mycobacteriology laboratory and new diagnostic techniques. 

Infect Dis Clin North Am, 2002; 16(1): 127- 144. 

6. Saniç A, Çoban AY. Mikobakteriler ve laboratuar tan›. Ondokuz May›s Üni 

T›p Fak Mik ve Kl Mik ABD, Samsun. 1999; 38-41. 

7. Fukunaga H, Murakami T, Gondo T, Sugi K, Ishihara T. Sensivity of acid- fast 

staining for Mycobacterium tuberculosis in formalin-fixed tissue. Am J Respir Crit 

Care Med, 2002;166(7):994-7. 

8. Ba F, Rieder HL. A comparison of fluorescence microscopy with the Ziehl- 

Neelsen technique in the examination of sputum for acid- fast bacilli. Int J Tuberc 

Lung Dis, 1999; 3(12): 1101- 5. 

9. Kumar N, Tiwari MC, Verma K. AFB staining in cytodiagnosis of tuberculosis 

without classical features: a comparison of Ziehl- Neelsen and fluorescent methods. 

Cytopathology, 1998; 9(3):208-14. 

Saceanu CA, Pfeiffer NC, McLean T. Evaluation of sputum smears concentrated 

by cytocentrifugation for detection of acid-fast bacilli. J Clin Microbiol 1993; 

31:2371-2374. 

33

AURAM‹NE – RHODAM‹NE FLORESAN BOYAMA 

Dr. Vildan AVKAN O⁄UZ 

DEÜ T›p Fakültesi ‹nfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji AD. 

Direkt mikroskopi teknikleri konusunun giriflinde verilen genel bilgiler ve 

yayma preparat›n haz›rlanmas› aflamalar› hem karbol fuksin boyama hem 

florokrom boyama yöntemlerinde ayn›d›r. Rutinde tan› amaçl› en s›k karbol 

fuksinli (Erlich Ziehl Neelsen- EZN , Kinyon) boyama kullan›lmakla birlikte, daha 

duyarl› ve haz›rlanan preparat›n daha h›zl› taranmas›n› sa¤layan florokrom 

boyalar da kullan›labilir. Bu boyama yöntemlerinde, daha küçük bir büyütme ile 

daha genifl bir alan taranabilir ve preparat›n taranmas› için gereken zaman azal›r. 

Bu nedenle özellikle zaman problemi olan ve fazla say›da hasta örne¤inin 

ifllemlendi¤i laboratuvarlarda, florokrom boyama yöntemleri hem tan› için hem 

de antitüberküloz tedavi alan hastalar›n izleminde tercih edilebilir. 

Florokrom boyamada ana ilke fenollü fuksin yerine floresan boyalar›n 

kullan›lmas›d›r. Floresan boyalar, mikobakterilerin lipitten zengin hücre duvar›na 

ba¤lanarak, görünür hale gelmesini sa¤lar. Ancak boyalar›n haz›rlanmas›, 

amaçlanan hedef (doku, mikroorganizma, antijen antikor kompleksi vs.) ve 

boyama ifllemi s›ras›nda ›s›-süre de¤iflikliklerinin uygulanmas› gibi, baz› kriterlere 

göre, farkl› floresan boyama yöntemleri uygulanabilir. Bu yöntemler aras›nda 

Auramin-Fenol boyama yöntemi, Glikerson ve Kanner’in floresanl› boyama 

yöntemi, Auramine-Rhodamine boyama yöntemi, Truant’›n modifiye Auramine- 

Rhodamine boyama yöntemi say›labilir. Kullan›lan auramin’in karsinojen oldu¤u 

unutulmamal›, özellikle direkt temas-hava yolu izolasyon önlemleri al›nmal›d›r. 

AURAM‹N-RHODAM‹NE BOYAMA ‹fiLEM BASAMAKLARI 

A. Örneklerin Haz›rlanmas› : Karbol Fuksin boyama yönteminde anlat›ld›. 

B- Kimyasal Maddelerin Haz›rlanmas› 

34

2.Asit Alkol Haz›rlanmas› 

Etil alkol (% 70’lik) ---------- 99.5 ml 

Konsantre HCl------------------ 0.5 ml 

3.Karfl›t Boya Çözeltisi Haz›rlanmas› 

Potasyum permanganat (KMnO4) --------- 0.5 gr 

Distile su--------------------------------------- 100 ml 

C- Kalite Kontrol 

Her boyama için mutlak pozitif ve negatif kontroller haz›rlanmal›d›r. 

Pozitif kontrol haz›rlanmas›: Middleebrook 7H9 s›v› besiyeri içinde mikobakteri 

(mümkünse standart M tuberculosis H37Rv) süspansiyonu haz›rlan›r.Bu 

süspansiyondan lam üzerine bir damla konularak ya ›s›t›c› blokta ya da havada 

kurutulup, tespit edilir. 

Negatif kontrol haz›rlanmas›: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas 

aeruginosa ile s›v› besiyerinde haz›rlanan süspansiyondan bir damla lam üzerine 

konularak ya ›s›t›c› blokta ya da havada kurutulup, tespit edilir. 

D- ‹fllemin Uygulanmas› 

• Oda ›s›s›nda saklanan boyalar kullan›lmadan önce mutlaka iyice çalkalanmal›d›r. 

• Haz›rlanan lamlar alevde fiske edilir. (Resim 1) 

• Haz›rlanan lamlar›n üzerine AR boyas› dökülür ve 15-20 dakika oda ›s›s›nda 

beklenir. Boya lam›n üzerini tamamen kaplamal› ve eksilmemelidir (Resim 2,3). 

• Distile su ile y›kan›r. Klorsuz su kullan›lmal›d›r, çünkü klor floresan› azalt›r 

(Resim 4). 

• Y›kama sonras› % 0,5 asit alkol dökülerek 2–3 dakika beklenir. Yeterli 

dekolarizasyon iflleminde ç›plak gözle boya görülmez(Resim 5–7). 

• Y›kama ifllemi tekrarlan›r (Resim 8). 

• Zemin boyas› olarak haz›rlanm›fl KMnO4 ile 2 dakika boyan›r. Süre uzat›l›rsa 

floresan azalabilir (Resim 9). 

• Y›kan›r ve havada kurutulur (Resim 10). 

• Pozitif bir yaymada mikobakteriler, karanl›k bir zeminde sar›-turuncu parlak, 

ince, k›vr›k içi tanecikli floresan veren bakteriler olarak görülür (Resim 11) 

• Her örne¤in boyanmas› s›ras›nda, mutlaka pozitif ve negatif kontrol 


35

• Boyanan preparatlar en k›sa sürede 25x ya da 40x büyütme ile floresan 

mikroskobunda incelenmelidir. Basil morfolojisi x1,000 ya da x450 büyütme ile 

kontrol edilmelidir. 

• Gerekirse pozitif de¤erlendirilen preparatlar, EZN ya da Kinyon boya ile 

boyanabilir. 

E. SONUÇLARIN B‹LD‹R‹M‹: 

Negatif: Floresan görülmeyen tüm yaymalar “ Aside dirençli basil görülmedi ‘’ 

fleklinde raporlan›r. 

Pozitif: Karanl›k bir zeminde sar›-turuncu parlak, ince, k›vr›k içi tanecikli floresan 

veren bakteriler olarak görülür “Aside dirençli basil görüldü’’ fleklinde rapor 

edilir. Boyanma yöntemi belirtilir ve yaymada gözlenen aside dirençli basilin 

miktar› hakk›nda bilgi verilir. Basilin miktar› hakk›ndaki de¤erlendirmede karbol 

fuksin boyama yönteminde kullan›lan tablo rehber olarak kullan›r. 

Resim 1–11: Auramine – Rhodamine Floresan Boyama iflleminin resimlerle izlemi 

1 2 

3 4 

36

5 6 

7 8 

9 10 

11 

37

KAYNAKLAR 

1. Weitzman I. Mycobacteriology and Antimycobacterial Susceptibility Testing. 

Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook ASM Press, Washington 

DC, 2004; 7.2.1- 7.3.1. 

2. Bilgehan H. Klinik Mikrobiyolojik Tan›. ‹kinci bas›m Bar›fl yay›nlar›. ‹zmir 1995 

: 83-84. 

3. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC. Color 

Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Fifth edition Lippincott, 

Philadelphia.1997: 903 – 905. 

4. Uzun M. Tüberküloz tan›s›nda Ehrl›ch-Ziehl-Neelsen, Fluorokrom boyama 

yöntemleri ile BACTEC ve Löwenstein-jensen Kültür yöntemlerinin sonuçlar›n›n 

de¤erlendirilmesi Doktora tezi. ‹stanbul T›p Fakültesi. 1994. 

5. Baron JB, Peterson LR,Finegold SM. Bailey Scott’s Diagnostic Microbiology 

9th edition. Mosby-Year Book, St Louis, Missouri. 1995:605-608. 

6. Nolte FS, Metchock B. Mycobacterium. In: Murray PR, Baron EJ,Pfaller MA, 

Tenover FC, Yolken RH eds. Manuel of Clinical Microbiology 6th ed. Washington. 

ASM Press. 1995: 400-38. 

7. http://www2.provlab.ab.ca/bugs/mycob/afb_stain/znstain.htm 

38

TÜBERKÜLOZ BAS‹L‹N‹N KLAS‹K YÖNTEMLERLE 

‹DENT‹F‹KASYONU 

Prof.Dr. Süheyla SÜRÜCÜO⁄LU 

Celal Bayar Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD, 

Manisa 

Tüberküloz basillerinin tan›mlanmas›nda kullan›lan klasik yöntemler 

bakterilerin üreme h›z›na, üreme ›s›s›na, koloni görünümüne, pigment üretimine 

ve biyokimyasal özelliklerine dayal› yöntemlerdir. Bu yöntemler zaman al›c› ve 

uygulanmas› zor olmakla birlikte maliyetleri yeni yöntemlere göre oldukça 

düflüktür. Tüberküloz basillerinin identifikasyonunda klasik yöntemler alt›n 

standart özelli¤ini halen korumaktad›rlar. 

A. ÜREME ÖZELL‹KLER‹N‹N ‹NCELENMES‹ 

1. Koloni ve Mikrokoloni Görünümü 

M. tuberculosis 

• Lowenstein Jensen (LJ) besiyerinde veya Middlebrook agarda 370C’de 14-28 

günlük inkübasyondan sonra pigmentsiz, düzensiz, kuru, krem renkli koloniler 

oluflturur. 

• Middlebrook 7H10 veya 7H11 agarda 5-10 günlük inkübasyondan sonra 

oluflan mikrokoloniler mikroskop alt›nda incelendi¤inde “y›lanvari kordon” 

görünümü izlenir. 

• Petrilere ince dökülmüfl agarl› besiyerindeki mikrokoloniler 10X objektif ile 

mikroskopta incelenmelidir. 

M. bovis 

• Çok yavafl (disgonik)ürer. LJ’de görünür kolonilerin oluflmas› için 6-8 haftal›k 

inkübasyon gereklidir. 

• En iyi üreyebildigi ortam gliserolsüz %0.4 pirüvatl› LJ’dir. Yumurtal› besiyerinde 

düzgün veya bazen düzensiz kenarl›, krem renkli, küçük koloniler oluflturur. 

Middlebrook 7H11 agarda çok küçük, su damlas›na benzer koloniler oluflturur. 

2. Üreme H›z›n›n ve Pigment Üretiminin Saptanmas› 

Mikobakteriler üreme h›zlar›, tercih ettikleri üreme ›s›lar› ve ›fl›kta veya ›fl›k 

olmadan pigment üretme özelliklerine göre s›n›fland›r›labilmektedir. Bu 

s›n›fland›rma (Runyon) 1950’li y›llardan beri geçerlili¤ini korumaktad›r. Tüberküloz 

basilleri yavafl üreyen, nonfotokromojen (veya nonkromojen) koloniler yapar. 

39

Gereçler: 

1 Middlebrook 7H9 broth veya Dubos Tween broth ve LJ yat›k besiyeri 

2 Steril vidal› kapakl› tüpler (20 X 110 veya 20 X 125 mm) 

3 Steril plastik çubuklar ve pastör pipetleri 

4 Besiyerinin üzerini kapatacak büyüklüklerde (yaklafl›k 10X15 cm) alimünyum 

folyo parçalar› 

5 60-W ayd›nlatma gücünde lamba 

Kalite Kontrol: 

Afla¤›da verilen kontrol sufllar› ile test ayda bir kez kontrol edilmelidir. 

1 M. terrae ATCC 15755: Yavafl ürer, oda ›s›s›nda ± ürer, ›fl›kta veya karanl›kta 

pigment yapmaz (nonkromojen). 

2 M. fortuitum ATCC 6841: H›zl› ürer, oda ›s›s›nda iyi ürer, ›fl›kta veya karanl›kta 

pigment yapmaz (nonkromojen). 

3 M. gordonae ATCC 14470: Yavafl ürer, oda ›s›s›nda zay›f ürer, ›fl›kta ve 

karanl›kta turuncu pigment yapar (skotokromojen). 

4 M. kansasii ATCC 12478: Yavafl ürer, oda ›s›s›nda çok zay›f ürer, ›fl›kta turuncu 

pigment yapar, karanl›kta pigment yapmaz, ›fl›k testinden sonra pigment oluflumu 

gözlenir (fotokromojen). 

Yöntem: 

• Test edilecek koloniler Middlebrook 7H9 broth besiyerine ekilir. Bir çubuk ile 

tüpün kenar›nda iyice ezilerek kolonilerin s›v› besiyeri içinde da¤›lmas› sa¤lan›r. 

• Tüpler vorteks arac›l›¤› ile 10 saniye kar›flt›r›ld›ktan sonra bir pastör pipeti 

arac›l›¤› ile alt›flar damla kültür süspansiyonu al›narak üç ayr› LJ besiyerine ekilir. 

• LJ besiyerlerinden iki tanesi besiyerinin tamam›n› örtecek flekilde hemen 

alüminyum folyo ile kapat›l›r. Tüplerin kapaklar› gevflek b›rak›lmal›d›r. 

• Kapal› tüplerden biri oda derecesinde (220-250C), di¤er kapal› tüp ile aç›k 

b›rak›lan tüp 370C’de %10 CO2’li ortamda inkübe edilir. 

• Aç›k tüp haftada bir kez olmak üzere üç hafta süre ile üreme miktar› ve 

pigment üretimi yönünden incelenir. Üçüncü haftan›n sonuna kadar alimünyum 

folyo aç›lmaz. 

• Koloni rengi kaydedilir. Üreme skoru (0) – (2+) olarak belirlenir (Tablo 1) 

• Üçüncü haftan›n sonunda folyo aç›l›r. Aç›lan tüplerde üreyen kolonilerin 

rengi kaydedilir. Aç›k tüpler daha fazla ›fl›¤a maruz kald›¤›ndan bu tüplerde 

üreyen kolonilerin pigmentleri kapal› olanlara oranla genellikle daha koyudur. 

40

Ayn› zamanda oda ›s›s›nda üreyen kolonilerin pigmentleri ›s› derecesine ba¤l› 

olarak daha aç›k renktedir. Renk tonu k›yaslanmamal›, sadece sar› veya turuncu 

pigmentin olup olmad›¤› incelenmelidir. 

Tablo 1. Besiyerinde üreme h›z›* 

* 0; görünür koloni yok, ±; yüzeyde çok az say›da küçük kolonilerin görülmesi veya çok hafif pigment 

oluflumunu düflündüren görünüm, 1+; az say›da iyi üremis kolonilerin görülmesi, kolonilerin aras›ndan 

LJ besiyeri seçilebilir, 2+; çok say›da iyi üremis kolonilerin görülmesi, koloniler birbirine çok yak›nd›r 

veya temas halindedir ve kolonilerin aras›ndan besiyerinin yüzeyi görülemez. 

De¤erlendirme 

• Aç›k ve kapal› tüplerde üreyen kolonilerde pigment yok (krem rengi); 

Nonkromojenik 

• Aç›k ve kapal› tüplerde üreyen kolonilerde pigment var (sar›-turuncu); 

Skotokromojenik 

• Ifl›k testi : Aç›k tüpte üreyen koloniler pigmentli, kapal› tüpte üreyenler 

renksiz ise kapal› tüpe ›fl›k testi uygulan›r. Kapal› tüpte bulunan pigmentsiz 

kolonilerde, ›fl›kla karfl›laflt›ktan sonra pigment üretimi var; Fotokromojenik 

Bu amaçla besiyeri 25 cm uzakl›kta bulunan 60 W gücündeki lamban›n alt›nda 

bir saat tutulur. Daha sonra bafllang›çta tüpün bekletildi¤i ›s›da inkübe edilir. 

Kapa¤› gevflek b›rak›lmal›d›r. 24 saatlik inkübasyonun sonunda koloniler pigment 

oluflumu yönünden yeniden incelenmelidir. Sar› veya turuncu pigment varl›¤› 

kaydedilir. Pigmentin koyulu¤u de¤il, varl›¤› aranmal›d›r. 

3. Bactec NAP (p-Nitro-a-acetylamino-ß-hydroxypropiophenone) Testi 

NAP M. tuberculosis complex’in üremesini selektif olarak inhibe eder. Di¤er 

41

mikobakteri türleri NAP ile inhibe olmaz veya k›smen inhibe olabilir. Üreme 

yoksa bakterinin M. tuberculosis complex’e ait oldu¤u düflünülür. Ancak NAP 

testinin nükleik asit prob, kromotografik yöntemler veya konvansiyonel yöntemler 

ile do¤rulanmas› önerilmektedir. 

‹nceleme Örnegi 

BACTEC 12B besiyeri (Growth index > 50 ise ) 

Gereçler 

• BACTEC 460 cihaz› (Becton Dickinson Diagnostic Systems) 

• Middlebrook 7H12 (BACTEC 12B) besiyeri (7H9 broth, s›¤›r serum albümini, 

kazein hidrolizat, katalaz ve 14C iflaretli substrat içerir.) 

• BACTEC NAP flakonlar› (5 μg NAP diski tafl›r). 

• Steril tüberkülin enjektörleri 

• Pamuk veya gazl› bezli petler, antimikobakteriyel dezenfektan ve %70 etil 

alkol 

Kalite Kontrol Sufllar› 

M. tuberculosis ATCC 27294 ve M. kansasii ATCC 35775; M. tuberculosis’in growth 

index’inde (GI) %20 azalma gözlenirken, M. kansasii’nin GI inkübasyon sürdükçe 

yükselen bir e¤ri çizer. 

Yöntem 

• BACTEC 12B fliflesinde GI 10 oldu¤unda çukulata agara ekilir, kontaminasyon 

olmad›¤› do¤rulan›r. GI yaklafl›k 50-100’e ulafl›ncaya kadar besiyerleri günlük 

olarak okunur ve yayma haz›rlanarak ARB’nin varl›¤› gösterilir. 

• 12B fliflesinin GI’i 50-100’e ulaflt›¤›nda, besiyeri iyice kar›flt›r›l›r. Aseptik 

koflullarda 1 ml besiyeri NAP flakonuna aktar›l›r Kalan 3 ml besiyeri kontrol olarak 

kullan›l›r. 

• GI 100’ü geçen kültürler için NAP testinden önce ekim yap›lmam›fl BACTEC 

12B besiyeri (Middlebrook 7H12) ile dilüsyon yapmak gereklidir. Dilüsyon oranlar› 

afla¤›da gösterilmifltir. 

42

GI Miktar› 

Dilüsyon 

50-100 Dilüsyon yap›lmaz 

101-200 0.8 ml 

201-400 0.6 ml 

401-600 0.4 ml 

601-800 0.3 ml 

801-999 0.2 ml 

999>1 gün 0.1 ml 

• Dilüsyon yap›ld›ktan sonra besiyerinin 1 ml’si NAP flakonuna aktar›l›r. 

• Artan besiyeri kontrol olarak kullan›lmak üzere inkübe edilir. 

• Flakonun a¤z› etil alkolle dekontamine edilir ve iyice kar›flt›r›l›r. 

• Hem inokülasyon yap›lan primer izolasyon fliflesi (kontrol), hem de NAP 

flakonlar› günlük olarak 2-7 gün süre ile okunur, GI kaydedilir. 

De¤erlendirme: 

• Sonuçlar 2-7 gün içinde de¤erlendirilir. Kontrol fliflesinin GI’i artmas›na ra¤men 

NAP testi fliflesinin GI’i azal›yor veya de¤iflmiyorsa M. tuberculosis kompleks, art›fl 

gösteriyorsa tüberküloz d›fl› mikobakteri (MOTT) olarak de¤erlendirilir. 

• Test sonucu dört günden daha k›sa sürede de¤erlendirilmemelidir. 

• M.tuberculosis kompleks d›fl›nda di¤er mikobakterilerden M. kansasii, M. 

gastri, M. szulgai, M. terrae ve M. triviale’nin baz› sufllar› NAP ile k›smen inhibe 

olabilir. Bu durumda ilk 2-4 günlük okuma sonuçlar› yanl›fl de¤erlendirilebilir. 

Sonuç vermeden önce inkübasyonun 2-3 gün daha uzat›lmas› bu hatay› 

önleyecektir. 

• NAP testinde optimal inkübasyon ›s›s› önemlidir. Baz› mikobakteriler (M. 

marinum, M. chelonae) 300C’de ürer. 370C’de yap›lan NAP testinde üremeleri 

inhibe olur. Bu nedenle yara veya deri örneklerinden üreyen mikobakterilerin 

ayr›m› için NAP testinde inkübasyon ›s›s› hem 370C hem de 300C olmal›d›r. 

• Kontrol fliflesindeki (orijinal kültür fliflesi) günlük GI artmaya devam etmelidir, 

art›fl göstermiyorsa NAP sonucu de¤erlendirmeye al›nmamal›d›r. 

o M. tuberculosis kompleks: ‹nokülasyondan sonra ard›fl›k iki GI’de önemli bir 

azalma (%20); ilk iki gün hafif, fakat önemli olmayan bir art›fl ve ard›ndan art›fl›n 

olmamas› veya azalma olmas› = TB kompleks 

o Tüberküloz d›fl› mikobakteri: Günlük GI’in dört gün içinde 400 ve üzerine 

43

ç›kmas›; inokülasyondan sonra ilk 1-2 gün içinde art›fl olmamas› veya hafif bir 

azalma, iki günün ard›ndan önemli bir art›fl (%20) olmas› = Tüberküloz d›fl› 

mikobakteri 

o Kültürlerin birden fazla mikobakteri türü ile veya di¤er bakteriler ile kontamine 

olmas›, GI’in yükselmesine neden olur ve yanl›fl olarak tüberküloz d›fl› mikobakteri 

olarak de¤erlendirilir. Bu nedenle kuflkulu durumlarda ARB ve Gram boyama 

yap›lmal›d›r. 

B. B‹YOK‹MYASAL ÖZELL‹KLER‹N ‹NCELENMES‹ 

I. Niasin Testi 

Bütün mikobakteriler niasin ribonükleotid üretir. Ancak M. tuberculosis ile M. 

simiae ve M. chelonae’n›n baz› sufllar› niasini nikotinamid adenin dinükleotide 

(NAD) dönüfltürecek enzime sahip de¤ildir. Besiyerinde biriken niasin gösterilebilir. 

Niasin olumsuz M. tuberculosis sufllar› çok nadirdir. Niasin testi M. tuberculosis’in 

identifikasyonunda tek bafl›na kullan›lmamal›d›r. M. tuberculosis 

identifikasyonunda sonuçlar nitrat redüksiyonu ve ›s›ya stabil katalaz testi ile 

do¤rulanmal›d›r. Niasin testi ticari olarak haz›rlanm›fl ka¤›t stripler ile de yap›labilir. 

‹nceleme Örne¤i : Niasin testi için LJ besiyerinde yo¤un olarak üremifl dört haftal›k 

kültürler kullan›lmal›d›r. Di¤er besiyerlerinde yeterince niasin birikmedi¤inden 

yanl›fl negatif sonuç al›nabilir. Di¤er bakteriler ile kontamine kültürlerde niasin 

metabolize oldu¤undan yanl›fl negatif sonuçlar al›nabilir. 

Gereçler 

1. %4’lük anilin 

4 ml renksiz anilin 96 ml %95’lik etanole eklenir. Kar›flt›r›l›r ve 20-80C’de koyu 

renk bir fliflede saklan›r. Solüsyonun rengi sar›ya dönüfltü¤ünde kullan›lmamal›d›r. 

Anilin karsinojeniktir. ‹nhalasyonu veya deri ile temas› zararl›d›r. 

2. %10’luk siyanojen bromid eriyi¤i 

Siyanojen bromidin doymufl bir çözeltisidir. Siyanojen bromid kristallerine steril 

distile su eklenerek haz›rlan›r. Boflalan flifleler at›lmadan önce bol miktarda %10 

NaOH ile y›kanmal›d›r. Bu çözelti ile çal›fl›rken son derece dikkatli olunmal›d›r. 

Kuru kristaller patlay›c›d›r. Ayr›ca siyanojen bromid asitle birleflti¤inde zehirli 

siyanür gaz› oluflur. 

3. Steril vidal› kapakl› tüpler (20 X 110 veya 20 X 125 mm), steril pastör pipetleri 

ve steril 5 ml’lik pipetler 

44

Kalite kontrol 

Pozitif kontrol; M. tuberculosis ATCC 25177 

Negatif kontrol; MAC ATCC 13950 ve ekim yap›lmam›fl besiyeri 

Yöntem 

• Dört haftal›k ve yo¤un üremesi olan LJ kültürleri kullan›lmal›d›r. Koloni say›s› 

az oldu¤unda yanl›fl negatif sonuçlar al›nabilir. 

• Besiyerine bir pastör pipeti dolusu steril su veya serum fizyolojik eklenir. Pipet 

ile koloniler yerlerinden kald›r›l›p yana çekilerek suyun besiyeri ile temas› sa¤lan›r. 

Bu ifllemin yap›lmamas› yanl›fl negatif sonuca neden olabilir. 

• Tüpler horizontal olarak oda ›s›s›nda bir saat bekletilir. Bir pastör pipeti 

dolusu geri al›nan s›v› temiz bir tüpe aktar›l›r. 

• Tüpe birer pastör pipeti dolusu % 4 anilin ve siyanojen bromid eklenir. 

• Ka¤›t strip yönteminde ise ay›raçlar yerine tüp içine strip konur ve hemen 

tüpün a¤z› kapat›l›r. Tüp ara s›ra çalkalanarak oda ›s›s›nda 15 dakika bekletilir. 

De¤erlendirme : Befl dakika sonra sar› renk oluflmas› pozitif sonuç olarak kaydedilir. 

Renk de¤iflikli¤inin görülmemesi negatif olarak de¤erlendirilir. Tüpler at›lmadan 

önce eflit miktarda %10 NaOH eklenmelidir. Ka¤›t strip yöntemi ile ilgili olarak 

, beyaz zeminde de¤erlendirildi¤inde sar› renk gözlenmesi pozitif kabul edilir. 

Ka¤›t stripler tehlikeli ay›raçlar›n kullan›m›n› gerektirmedi¤inden ve raf ömürleri 

uzun oldu¤undan avantajl›d›rlar. Ancak az miktardaki niasini saptamada 

duyarl›l›klar› düflüktür. 

II. Nitrat Redüksiyonu Testi 

Mikobakteriler nitroredüktaz enzimi üreterek nitratlar› nitritlere indirgeyebilirler. 

Nitrat redüksiyonu testi; koloni morfolojisi, üreme h›z› ve pigment üretme 

özellikleri birbirine benzer olan mikobakterileri ay›rt etmede de¤erlidir. M. 

tuberculosis, M. kansasii, M. szulgai, baz› saprofit nonkromojenler, M. smegmatis 

ve M. fortuitum grubu nitrat redüktaz pozitiftir. Test niasin ka¤›t strip yöntemi 

ile de kombine edilebilir. 

‹nceleme Örnegi: LJ veya di¤er yumurtal› besiyerinde üreyen 3-4 haftal›k kültürler 

Gereçler 

1. Steril pastör pipetleri 

2. M/45 fosfat tampon eriyi¤i (0.02M, pH 7.0) içindeki nitrat test substrat› (0.01M) 

45

NaNO3 0.8 g 

KH2PO4 1.17 g 

Na2HPO4 1.93 g 

H2O 

1000.0 ml (final volüm) 

pH: 7.0 olmal›d›r. 

Çözelti otoklavda steril edildikten sonra buzdolab›nda 1-2 ay saklanabilir. 

3. Sulfanilamid’in sudaki %0.2’lik eriyi¤i 

0.1 gram sulfanilamid 50 ml distile suda çözünür. Tam çözünürlük için su banyosu 

gerekebilir. Çözelti koyu renkli fliflelerde, buzdolab›nda bir aya kadar saklanabilir. 

4. N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride’in sudaki %0.1’lik eriyi¤i 

Koyu fliflelerde, buzdolab›nda bir aya kadar saklanabilir. 

Kalite Kontrol 

Pozitif kontrol; M. tuberculosis ATCC 25177 

Negatif kontrol; M. intracellulare ATCC 13950, ekim yap›lmam›fl besiyeri 

Yöntem 

• Bir öze dolusu koloni 2 ml nitrat substrat› içinde ezilir ve elle kar›flt›r›ld›ktan 

sonra 350-370C’de iki saat inkübe edilir. 

• S›ras› ile afla¤›daki ay›raçlar eklenerek kar›flt›r›l›r. 

1 damla konsantre HCl 

2 damla %0.2 sulfanilamid 

2 damla N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride’in sudaki %0.1’lik 

eriyi¤i 

• Kar›fl›m oda ›s›s›nda 5 dakika bekletilir ve pembe-k›rm›z› renk de¤ifliminin 

varl›¤› araflt›r›l›r. 

De¤erlendirme: Pembe-k›rm›z› renk oluflmas› pozitif olarak kabul edilir. Baz› 

laboratuvarlarda renk de¤iflimi kantitatif olarak de¤erlendirilmektedir. 

Beklendi¤inde renk de¤iflimi kaybolabildi¤inden de¤erlendirme hemen yap›lmal›d›r. 

III. Katalaz Testi 

Katalaz hidrojen peroksidi (H2O2) su ve oksijene ayr›flt›ran hücre içi bir enzimdir. 

Oksijenin oluflumu hava kabarc›klar›n›n ortaya ç›kmas› ile anlafl›l›r. Katalaz 

46

enziminin baz› formlar› 680C’de 20 dakika ›s›t›ld›¤›nda inaktive olur. Enzimin ›s› 

ile inaktivasyonu baz› mikobakteri türlerinin ay›rt edilmesinde de¤erli bir tan› 

yöntemi olarak kullan›lmaktad›r. Mikobakteri türlerinin identifikasyonunda 

kullan›lan H2O2, di¤er bakterilerde bulunan enzimin araflt›r›lmas›nda kullan›lan 

ay›raçtan farkl›d›r. Hidrofobik ve kümeli olan mikobakterilerin da¤›lmas›n› ve 

enzimin kolayca aç›¤a ç›kmas›n› sa¤lamak için testte %30 H2O2 (Superoxol) ile 

güçlü bir deterjan olan %10 Tween 80’nin kar›fl›m› kullan›l›r. Ay›raçlar taze 

haz›rlanm›fl olmal›d›r. 

‹nceleme Örnegi : LJ veya Middlebrook 7H10 agarda üreyen geliflmifl mikobakteri 

kolonileri 

Gereçler 

1. Middlebrook 7H9 broth 

2. 25 X 150 mm büyüklü¤ünde vidal› kapakl› tüplerde haz›rlanm›fl dik LJ besiyeri 

3. %30 Hidrojen peroksit (Superoxol) 

4. %10 Tween-80 (90 ml distile su+10 ml Tween 80 kar›fl›m›, her ikisi de ›s›t›l›rsa 

kar›fl›m› haz›rlamak kolaylaflir). 

5. M / 15 fosfat tampon (0.067 M) 


Negatif kontrol: M. tuberculosis ATCC 15177, 22-250C’de hava kabarc›klar› oluflur, 

680C’de oluflmaz. 

Pozitif kontrol: M. fortuitum ATCC 6841, her iki derecede de hava kabarc›klar› 

oluflur. 

Yöntem : ‹ki farkl› yöntem uygulan›r. 

a. Is›ya stabil katalaz testi 

• ‹ki ayr› tüpte test edilecek birkaç mikobakteri kolonisi (2-4 haftal›k) 0.5 ml 

fosfat tampon içine inoküle edilir. Tüplerden biri 680C’lik su banyosunda 20 

dakika bekletilir. Di¤er tüp kontrol için kullan›l›r. 

• Is›t›lm›fl tüpün oda ›s›s›nda so¤umas› için bekletildikten sonra her iki tüpe de 

0.5 ml Tween-H2O2 kar›fl›m› (1/1 oranda) eklenir ve gaz kabarc›klar›n›n oluflumu 

gözlenir. Tüpler çalkalanmamal›d›r. Negatif sonuç verilmeden önce 20 dakika 

beklenmelidir. 

47

. Semikantitatif katalaz testi 

• Middlebrook 7H9’a bir öze dolusu koloni inoküle edildikten sonra tüp 370C’de 

yedi gün bekletilir. 

• ‹nkübasyonun sonunda vorteks ile 5-10 saniye kar›flt›r›l›r ve alt› damla dik LJ 

besiyerine aktar›l›r. Besiyerleri 14 gün 370C’de inkübe edilir. Kapak gevflek 

b›rak›lmal›d›r. 

• ‹nkübasyonun sonunda besiyerine 1 ml H2O2-Tween kar›fl›m› eklenir (%30 

peroksit cildi yakar, eldiven giyilmeli ve deri ile temas› oldu¤unda so¤uk su ile 

y›kanmal›d›r). Tüp oda ›s›s›nda befl dakika bekletilir. 

Oluflan hava kabarc›klar›n›n yüksekli¤i ölçülür. 

De¤erlendirme : Is›ya stabil katalaz testi: Çok az miktarda gaz kabarc›¤›n›n 

oluflmas› bile pozitif olarak de¤erlendirilir. M. tuberculosis ve di¤er baz› 

mikobakteriler 680C’de ›s›t›ld›klar›nda katalaz aktivitelerini kaybederler. 

Semikantitatif katalaz testi: 

• Güçlü katalaz reaksiyonu: Hava kabarc›klar›n›n yüksekli¤inin 45 mm oluflmas› 

M. kansasii, h›zl› üreyen mikobakteriler ve s›kl›kla izole edilen skotokromojenler 

güçlü katalaz reaksiyonu verir. 

• Zay›f katalaz reaksiyonu: Hava kabarc›klar›n›n yüksekli¤inin

‹nceleme Örne¤i: LJ veya Middlebrook 7H10 agarda üreyen 3-4 haftal›k kültürler 

Gereçler 

1. TCH duyarl›l›k besiyeri 

2. 35-370C, %10 CO2 atmosfer koflullar› için inkübatör 

3. Steril distile su 

4. Bölmeli petri plaklar› 


Pozitif kontrol: M. bovis ATCC 35734 (10 μg/ml TCH’e duyarl›) 

Negatif kontrol: M. tuberculosis ATCC 25177 (dirençli) 

TCH duyarl›l›k besiyerinin haz›rlanmas› 

• ‹ki adet 200 ml.lik Middlebrook 7H10 besiyeri haz›rlan›r. Besiyerleri otoklavda 

sterilize edilir. Su banyosunda 500C’ye kadar so¤utulur. 

• So¤umufl besiyerlerinden birinden 5.0’er ml pipet arac›l›¤› ile petri plaklar›n 

I. ve III. kadran›na dökülür. 

• Di¤er besiyerine 1000 μg/ml’lik TCH stok solüsyonundan 2.0 ml eklenir ve 

iyice kar›flt›r›l›r (final konsantrasyon; 10 μg/ml). Bu besiyerinden 5.0’er ml, II. ve 

IV. kadrana dökülür. 

• Besiyerleri karanl›kta (koyu renk ka¤›da sar›l› olarak), 2-80C’de bir ay süre ile 

saklanabilir. 

Yöntem 

• ‹ncelenecek mikobakteri kolonilerinin steril distile suda 1 McFarland standard›na 

uygun dilüsyonlar› yap›l›r. 

• Üçer damla bakteri süspansiyonu, bir kontrol kadran›na ve bir TCH’li kadrana 

inoküle edilir. 

• Besiyerlerinin ›fl›ktan korunmas› için ka¤›tla kapat›ld›ktan sonra, inokülumun 

absorbe olmas› için oda ›s›s›nda yaklafl›k bir saat bekletilir. Besiyerleri ters çevrilerek 

370C’de %10 CO2’li ortamda üç hafta inkübe edilir. 

• ‹nkübasyonun sonunda kontrol kadran›nda ve TCH’li kadranda üreyen koloniler 

say›l›r. 

De¤erlendirme : TCH’li besiyerinde üreyen koloni say›s›, kontrol besiyerinde 

49

üreyen koloni say›s›n›n %1’inden fazla ise dirençli kabul edilir. 

V. Pirazinamidaz Testi 

Pirazinamidaz enzimi pirazinamidi (PZA) pirazinoik asit ve amonya¤a hidrolize 

eder. Pirazinoik asit besiyerine ferröz amonyum sülfat eklenmesi ile saptanabilir. 

Bu test M. marinum’u M. kansasii’den ve M. bovis’i M. tuberculosis’den ay›rt 

etmede yard›mc›d›r. M. tuberculosis dört gün içinde pozitif sonuç verir. PZA 

direnci olan M. tuberculosis sufllar›nda ise test sonucu negatiftir. 

‹nceleme Örnegi: LJ agar veya Middlebrook 7H10 agarda üreyen koloniler 

Gereçler 

1. Pirazinamidaz substrat besiyeri: 

6.5 g Dubos broth base bir litre distile suda çözünür. Besiyerine; 0.1 g PZA, 2.0 

g sodyum pirüvat ve 15 g agar eklenir. Besiyeri ›s›t›larak çözündürülür. Vidal› 

kapakl› tüplere 5.0 ml miktar›nda dökülür. Tüpler 15 dakika 1210C’de steril 

edildikten sonra dik durumda agar›n kat›laflmas› için bekletilir. Besiyeri 2-80C’de 

alt› ay saklanabilir. 

2. %1 ferröz amonyum sülfat: Steril tüpler içinde ve steril distile su ile 

kullan›lmadan hemen önce haz›rlanmal›d›r. 


Pozitif kontrol: M. intracellulare ATCC 13950 

Negatif kontrol: M. kansasii ATCC 12478 

Yöntem 

• Bir öze dolusu genç koloni iki adet pirazinamidaz agar›n yüzeyine inoküle 

edilir. Tüplerin kapaklar› gevflek b›rak›larak inkübe edilir. 

• Dört gün sonra tüplerden biri ç›kar›larak besiyerinin üzerine 1 ml taze 

haz›rlanm›fl %1 ferröz amonyum sülfat eriyi¤i eklenir. Oda ›s›s›nda 30 dakika 

bekletildikten sonra agarda pembe bir bant oluflumu gözlenir. 

• Negatif tüpler dört saat daha buzdolab›nda bekletildikten sonra renk oluflumu 

yönünden yeniden incelenir. 

De¤erlendirme: Dört saat sonra agar yüzeyinde ay›raç tabakas›nda pembe renk 

oluflumu pozitif kabul edilir. Negatif sonuç al›nd›¤›nda ikinci tüpün inkübasyonu 

50

yedi güne uzat›larak test tekrarlan›r. 

Tüberküloz basillerinin identifikasyonu için uygulanacak algoritma, laboratuvarda 

kullan›lan besiyerine ve olanaklara göre de¤iflkenlik gösterir. Kat› besiyeri kullanan 

laboratuvarlarda üreme h›z›, pigmentasyon, koloni görünümü ve mikrokoloni 

incelemesinden sonra niasin testi, nitrat redüksiyon testi ve ›s›ya stabil katalaz 

testinin uygulanmas› ile M. tuberculosis identifikasyonu yap›labilir. M. bovis ve 

M. tuberculosis ayr›m› için TCH ile inhibisyon testi tercih edilmelidir. BACTEC 

sistemi kullanan laboratuvarlar için M. tuberculosis kompleksin identifikasyonunda 

NAP testi h›zl› ve güvenilirdir. Ayn› zamanda s›v› besiyerinde kord faktör oluflumu 

aranmal›d›r. 

KAYNAKLAR 

1. Lee LV. Procedures for identification from culture; conventional biochemicals. 

In Isenberg HD (ed): Clinical Microbiology Procedure Handbook. Washington DC, 

American Society for Microbiology, 2004; p: 7.6.11-7.6.1.12. 

2. Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ. Mycobacterium. In: Murray PR, Baron EJ, 

Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds): Manual of Clinical Microbiology, 

Washington D.C: ASM Pres. 1999: 399-437. 

3. Siddiqi S. Procedures for identification from culture; BACTEC NAP Test. In 

Isenberg HD (ed): Clinical Microbiology Procedure Handbook. Washington DC, 

American Society for Microbiology, 2004, p: 7.6.3.1-7.6.3.3. 

51

ANT‹B‹YOT‹K DUYARLILIK TEST YÖNTEMLER‹ 

Yrd.Doç.Dr. Nuri ÖZKÜTÜK 

Celal Bayar Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD, 

Manisa 

M.tuberculosis complex’in (MTBC) anti tüberküloz ilaçlara karfl› duyarl›l›¤›n› 

belirlemede en güvenilir ve en h›zl› yöntemi bulmak amac›yla çok say›da duyarl›l›k 

test yöntemi gelifltirilmifltir. Bunlar aras›nda proprosiyon yöntemini temel alan, 

kültüre dayal› klasik testler en yayg›n kullan›lan testlerdir. Proporsiyon yönteminde 

kat› besiyeri olarak s›kl›kla yumurta bazl› besiyerlerinden Löwenstein-Jensen (LJ), 

agar bazl› besiyerlerinden Middlebrook (MD) 7H10 kullan›lmaktad›r. Modifiye 

Middlebrook 7H9 s›v› besiyerinin kullan›ld›¤› antimikobakteriyal duyarl›l›k test 

yöntemlerinden BACTEC 460TB ve BACTEC-MGIT 960 gibi h›zl› ticari sistemler de 

yayg›n olarak kullan›lmaktad›r. MD7H10’un kullan›ld›¤› agar proporsiyon yöntemi 

ile BACTEC 460TB ve BACTEC-MGIT 960 yöntemleri NCCLS (National Committee 

for Clinical Laboratory) taraf›ndan önerilen yöntemlerdir. LJ’nin kullan›ld›¤› 

proporsiyon yöntemi ise ekonomik olmas› nedeniyle DSÖ (Dünya Sa¤l›k Örgütünün) 

taraf›ndan önerilmektedir. 

I. M‹DDLEBROOK 7H10 BES‹YER‹NDE PROPORS‹YON YÖNTEM‹ 

(AGAR PROPORS‹YON YÖNTEM‹) 

Prensip: Proporsiyon yöntemi belli bir ilaç konsantrasyonunda (Kritik 

Konsantrasyon) dirençli olan organizmalar›n oran›n›n belirlenmesini sa¤lar. Test 

edilecek bakteri suflu ilaçl› ve ilaçs›z kat› besiyerlerine inkübe edilir. ‹laçl› besiyerinde 

üreyen kolonilerin say›s›, kontrol besiyerindeki kolonilerin say›s›yla karfl›laflt›r›l›r. 

Belli bir ilaca dirençli basillerin oran› hesaplan›p, test edilen popülasyona yüzdesi 

olarak belirtilir. Bu oran %1’e (Kritik Proporsiyon) eflit veya daha yüksek ise test 

edilen sufl o ilaca karfl› dirençli olarak rapor edilir. NCCLS, kat› besiyeri olarak 

MD7H10 besiyerinin kullan›ld›¤› proporsiyon test yöntemini (Agar Proporsiyon 

Yöntemi) referans yöntem olarak kabul etmektedir. 

52

Antibiyotik Solüsyonlar›n›n Haz›rlanmas›: 

Antibiyotikler ticari toz fleklinde üretici firmadan al›nmal›, klinik preparatlar› 

kullan›lmamal›d›r. Antibiyotikler üretici önerilerine göre veya olas› ise vakumlu 

bir desikatör içinde –20oC’de saklanmal›d›r. 

• Antibiyotiklerin steril distile su ile veya uygun çözücüler ile (SM, INH ve EMB 

için su, RIF için metanol veya dimetilsülfoksit) 10 000μg/ml’lik (en az 1000 μg/ml 

olmal›) stok solüsyonlar› haz›rlan›r (yaklafl›k olarak 100mg ilaç +10ml su). 

• Stok solüsyonlar haz›rlan›rken gerekli miktar antibiyotik üzerinde belirtilen 

potense (% veya μg/mg) göre flu formüle göre hesaplanmal›d›r. 

A¤›rl›k (mg) = Hacim (ml) x ‹stenilen konsantrasyon (μg/ml) 

o Potens (μg/mg) 

Veya gerekli olan miktar hesaplan›p, potense bölünerek kullan›lmas› gereken 

miktar bulunur. Ör: 100mg Streptomisin tartarak bir ilaç çözeltisi haz›rlamak 

istedi¤imizde, ilac›n potensi %80 (0.800μg/mg ) ise 100/0.800=125mg tartmak 

gerekir. Stok solüsyonlar yaklafl›k 100 mg’l›k antibiyotik miktar› ile haz›rlanmal›d›r, 

çünkü daha küçük miktarlarda do¤ru tart›m güç olabilir, daha büyük miktarlar 

ise ekonomik olmaz. 

• Stok solüsyonu 0.22 μm por çapl› membran filtreden süzüp steril ettikten 

sonra, polipropilen tüplerde daha sonraki kullan›mlara uygun küçük miktarlara 

bölünerek –20oC’nin alt›nda (tercihen –70oC) 1 y›l kadar saklanabilir. Stok solüsyon 

kullan›laca¤› zaman oda ›s›s›na getirilip, bekletilmeden kullan›l›r ve kalan› at›l›r. 

• Antibiyotikler besiyerlerine eklenmeden önce stok konsantrasyonlardan 

çal›flma konsantrasyonlar› haz›rlan›r ve besiyerlerine uygun miktarlarda eklenir. 

Örnek: 

1. 100mg EMB + 10ml steril distile su = 10 000μg/ml (stok solüsyon) 

2. Vortex 

3. Sterilizasyon (filtre ile) 

4. 1ml stok solüsyon + 9ml steril distile su = 1 000μg/ml (çal›flma solüsyonu) 

5. Vortex 

6. 1ml çal›flma solüsyonu + 200ml besiyeri = 5.0μg/ml (final konsantrasyon) 

‹laçlar›n önerilen çözücüleri, stok konsantrasyonlar›, çal›flma konsantrasyonlar› 

besiyerine eklenecek miktarlar ve besiyerlerindeki final konsantrasyonlar› Tablo 

1’de yer almaktad›r. 

53

‹laçl› ve ‹laçs›z Agar Besiyerinin Haz›rlanmas›: 

• Besiyerleri genellikle her biri 200ml’lik olacak flekilde 8 balon içinde haz›rlan›r. 

Her bir 200ml’lik 7H10 agar besiyerinin haz›rlanmas› için; bir cam balon içinde, 

180 ml distile su içine 3.8gr dehidrate 7H10 agar besiyeri ve 1 ml gliserol eklenerek 

eritilir (üretici firman›n önerdi¤i flekilde). 

• Otoklavda 121 ºC’de 15 dakika süreyle sterilize edilir. 

• Daha sonra 50-56ºC’lik su banyosunda so¤umaya b›rak›l›r. 

• Besiyeri s›cakl›¤› 50-56ºC’ye indi¤inde içine zenginlefltirici olarak 20 ml OADC 

(oleik asit, albumin, dekstroz ve katalaz kar›fl›m›) eklenir. 

(Bu aflamaya kadar olan basamaklar 8 ayr› balon yerine tek bir 2lt’lik cam 

balonda gerçeklefltirilip, daha sonra steril flartlarda 8 ayr› cam balona bölünebilir) 

• 8 ayr› balondaki besiyerinden 6’s›na her birine farkl› bir ilaç veya farkl› bir 

ilaç konsantrasyonu olacak flekilde, önceden haz›rlanan SM, INH, RIF ve EMB 

solüsyonlar› tablo 1’de belirtilen miktarlarda eklenir. Di¤er 2 besiyeri kontrol 

için ilaçs›z besiyeri olarak kullan›l›r. 

• Haz›rlanan ilaçl› ve ilaçs›z besiyerleri, önceden yaz›lm›fl-etiketlenmifl, 80 adet 

(40’arl›k 2 set), dört bölmeli steril, plastik petri plaklar›na, her bölmesine 5 ml 

(3-4mm kal›nl›¤›nda) olacak flekilde, tablo 2’de belirtilen düzende dökülür. 

Besiyerleri dökülürken, balonlar tek tek su banyosundan al›n›p iyice kar›flt›r›lmal›, 

agar kat›laflmadan hemen plaklara paylaflt›r›lmal› ve baloncuklar›n oluflmamas›na 

dikkat edilmelidir. 

• Direkt ›fl›ktan korunarak oda ›s›s›nda kat›laflan besiyerleri, kullan›mdan veya 

saklamadan önce yüzeyleri iyice kuruyuncaya kadar birkaç saat steril kabin içinde, 

kapaklar› hafif aral›k b›rak›lmal›d›r. 

• Daha sonra kurumaya engel olmak için deliksiz plastik torbalara konularak 

ve ›fl›ktan korunarak 4-80C’de 1 ay saklanabilir. 

• Dökülen her parti besiyerinden birkaç tanesi (ideali %10) kontaminasyon 

kontrolü için 350C’de 48 saat inkübe edilmelidir. 

‹nokulum Haz›rlanmas›: 

‹ndirekt yöntem: 

Agar proporsiyon yönteminde standart bir inokulumun haz›rlanmas› önemli 

oldu¤undan indirekt yöntem tercih edilir. ‹nokulum kayna¤› olarak genelde kat› 

besiyerinde üremifl 4-5 haftal›ktan daha eski olmayan koloniler kullan›l›r. Primer 

54

izolasyon kültürleri subkültüre tercih edilir. 

• Kat› besiyerinde üremifl koloniler, tüm üremeyi temsil edecek flekilde bol 

miktarda ve besiyerinden almamaya da dikkat edilerek, bir öze veya spatula 

yard›m› ile kaz›narak al›n›r. ‹çinde 6–10 adet cam boncuk bulunan 3-5ml tweenalbuminli 

s›v› besiyerinde (ör; %0.05 tween80 içeren Middlebrook 7H9) emulsifiye 

edilir. 

• 1–2 dakika süreyle vortekslenir. 

• Büyük partiküllerin çökmesi ve oluflan aerosollerin azalmas› için 20–30 dk 

süreyle tüp bekletilir. 

• Süpernatant steril pastör pipeti yard›m›yla bofl bir steril cam tüpe al›n›r. 

• S›v› besiyeri ekleyerek süspansiyonun bulan›kl›¤› McFarland no 1’e ayarlan›r 

(yaklafl›k 10 7 CFU/ml). 

• Daha sonra steril distile suyla (veya serum fizyolojik) bu süspansiyonun 10 -2 

(1/100) ve 10 -4 (1/10.000) dilüsyonlar› haz›rlan›r. 

örnek: 0.1ml ana süspansiyon (McFar.1) + 9.9ml steril distile su = 10 -2 ; 

0.1ml 10 -2 süspansiyon + 9.9ml steril distile su = 10 -4 

• Kat› besiyerinde yeterli üreme yoksa alternatif bir yol olarak, al›nan koloniler 

s›v› besiyerinde emulsifiye edildikten sonra inkübe edilerek bulan›kl›¤›n McFarland 

no 1’e ulaflmas› beklenilir ve buradan dilüsyonlar haz›rlan›r. ‹ndirekt yöntemde 

inokulum kayna¤› olarak kat› besiyeri yerine s›v› primer izolasyon besiyeri 

kullan›lacaksa, yine ayn› flekilde dilüsyonlar haz›rlan›r. 

Direkt yöntem: 

Homojenize,dekontamine ve konsantre edilen hasta örne¤inden haz›rlanan 

yayma preparatta yaklafl›k 20 mikroskop sahas› incelendikten sonra görülen aside 

dirençli basil say›s›na göre, örne¤in steril distile su ile dilüsyonlar› haz›rlan›r (tablo 

3). Daha sonra ki inokulasyon, inkübasyon ve de¤erlendirme aflamalar› indirekt 

testtekine benzer. Hasta tedavi alan ve tedavi baflar›s›zl›¤› söz konusu olan bir 

hasta ise, yayma sonuçlar›n› dikkate almaks›z›n mutlaka dilue edilmemifl hasta 

örne¤i de test edilir. Çünkü mikroskopide görülen basillerin tamam› kültürde 

üremeyecektir. 

55

‹nokulasyon ve ‹nkübasyon: 

• Antibiyotik duyarl›l›¤› test edilecek her bir mikroorganizma için; iki set test 

besiyeri (I ve II nolu plaklar›n her birinden 2’fler) oda ›s›s›na getirilir. Plak yüzeylerinin 

kuru olmas›na dikkat edilir. 

• Petri plaklar› hasta kültür numaras› ve dilüsyon oranlar›n› gösterecek flekilde 

(setlerden birini 10 -2 di¤erini 10 -4 ) iflaretlenir. 

• Önce I nolu setin her bir bölmesine önceden haz›rlanm›fl olan 10 -2 basil 

dilüsyonundan steril bir pipet kullanarak 0.1’er ml inokule edilir (veya pastör 

pipeti kullan›larak her bölmeye 3’er damla damlat›l›r). 

• Sonra II nolu set için ayn› ifllem 10 -4 dilüsyon ile tekrarlan›r. 

• ‹nokulumun saf olup olmad›¤›n› kontrol etmek amac›yla dilue edilmemifl 

süspansiyondan 1–2 damla bir adet kanl› agar besiyerine de ekim yap›l›r. 

• ‹nokulumun besiyerlerine absorbe olmas› için ‹nokule edilen plaklar› agarl› 

taraf› afla¤›da olmak üzere oda ›s›s›nda yaklafl›k 1 saat süreyle bekletilir (kapaklar 

hafif aral› flekilde steril kabin içinde bekletmek damlalar›n kurumas›n› 

kolaylaflt›rabilir). Bu ifllem esnas›nda, formaldehit oluflumunu önlemek için, plaklar 

›fl›ktan korunmal›d›r. 

• Her bir petri pla¤› ayr› bir CO2 geçirgen polietilen torbaya yerlefltirilir ve 

36°C’de % 5-10 CO2’li ortamda inkübasyona b›rak›l›r. 

Plaklar›n Okunmas› ve Yorumlama: 

• ‹nkübasyonun ilk 7 günü kontaminant bakteri varl›¤› yönünden kanl› agar 

incelenir. Kontaminasyon saptan›rsa, test tekrar edilir. 

• Test besiyerlerinde ise antibiyotiksiz kontrol bölmeleri üç hafta boyunca her 

hafta incelenir. Üçüncü hafta sonunda üreme yetersizse, test tekrar edilmelidir. 

• Üç haftadan önce kontrol bölmesinde 50 koloni üzerinde üreme (+1 veya 

daha fazla) görülürse test de¤erlendirilebilir ve dirençli sonuçlar rapor edilebilir. 

Fakat duyarl› sonuçlar› rapor etmek için üç hafta beklemek gerekir. Üçüncü 

haftadan sonra plaklar de¤erlendirilmemelidir. Dördüncü haftadan sonra beliren 

koloniler direnci göstermeyebilir. 

• ‹nkübasyon sonunda tüm kadranlardaki koloniler say›l›r ve tablo 4’e göre 

kantite edilir ve bir kay›t formuna kaydedilir. Mikroskopik inceleme ile görülebilen 

mikrokoloniler var ise, not edilir. 

56

• Afla¤›daki formül ile direnç oran› hesaplan›r. 

Direnç oran›(%) = ‹laçl› bölmedeki koloni say›s› X 100 

kontrol bölmesindeki koloni say›s› 

• Direnç oran› %1 ise sonuç dirençli;

önce stok solüsyonlar›ndan haz›rlanan çal›flma konsantrasyonlar› ve besiyerlerine 

eklenen miktarlar› farkl›d›r (tablo 5). 

‹laçl› ve ‹laçs›z LJ Besiyerinin Haz›rlanmas›: 

Afla¤›da 1600ml’lik Löwenstein-Jensen (L.J) besiyerinin haz›rlanmas› örnek olarak 

verilmifltir. Besiyeri haz›rlarken gerekli olan miktar hesap edilip ona göre haz›rl›k 

yap›lmal›d›r. 

Tuz solusyonu: 

Monopotasyum fosfat.....2400 mg 

Magnezyum sulfat.......... 240 mg 

Magnezyum sitrat...........600 mg 

L- Asparajin...................3600 mg 

Gliserin..............................12 ml 

Saf su...............................600 ml 

• Tuz solüsyonu bir balona konulup su banyosunda eritilir. 

• 115ºC’de 20 dk steril edilir. 

• 25 adet temiz, taze, iri boy yumurta sabunlu su ile iyice f›rçalanarak temizlenir. 

Yumurtalar genifl bir kap içinde varsa U.V. lamba alt›nda 45 dk steril edilir (veya 

15 dk %70’lik etanolde b›rak›l›r). Sonra büyükçe, a¤z› kapat›labilen, steril bir 

balona steril huni yard›m› ile k›r›larak konur. Homojen oluncaya kadar kuvvetlice 

çalkalan›r. 

• Daha önce haz›rlanm›fl ve steril edilmifl tuz solüsyonuna önce %2’lik malaflit 

yeflili 20-25ml ilave edilir. 

• Daha sonra homojen edilmifl 1000 ml yumurta temiz steril bir tülbent veya 

gazl› bez ile tuz solüsyonu içine süzülür. Böylece ana LJ besiyeri elde edilmifl olur. 

• Biri kritik konsantrasyon olmak üzere her bir ilaç için üç farkl› konsantrasyonda 

ilaçl› besiyeri dökmek için (Ör: INH 0.1 + INH 0.2 + INH 1.0); üzerleri etiketlenmifl 

üç balon jojeye 500’er ml besiyeri paylaflt›r›l›r. 

• Her birine tablo 5’de belirtilen miktarlarda ilac›n çal›flma konsantrasyonundan 

eklenir. Tüm ilaçlar için ayn› ifllem tekrarlan›r. 

• Ayr›ca 1000ml’lik bir besiyeri ilaçs›z kontrol besiyeri olarak b›rak›l›r. 

• Balonlar iyice çalkalan›p homojen olmas› sa¤land›ktan sonra üzeri etiketlenmifl, 

steril, vida kapakl› tüplere (16X160mm), her birine 5–7 ml olacak flekilde, aseptik 

flartlarda da¤›t›l›r. 

58

• Tüpler koagülatörde 78–80ºC’de 1 saat (veya 85ºC’de 45 dk) koagüle edilir. 

• 18–24 saat 37ºC’de sterilite kontrolü yap›ld›ktan sonra 2–8ºC bir ay saklanabilir. 

Not: Proporsiyon yönteminde dirence karar verirken kritik konsantrasyondaki 

üreme esas al›n›r. Di¤er konsantrasyonlar direncin derecesini belirlemede kullan›l›r. 

‹fl yo¤unlu¤unun yüksek oldu¤u durumlarda testi daha pratik hale getirmek için 

sadece kritik konsantrasyonlar test edilebilir (INH’›n yüksek konsantrasyonu da 

önerilmektedir). Tablo 5’de LJ besiyeri ile proporsiyon yönteminde kritik 

konsantrasyonlar ve önerilen di¤er konsantrasyonlar görülmektedir.. 

‹nokulum Haz›rlanmas›: 

‹nokulum haz›rlanmas› agar proporsiyon yönteminde anlat›ld›¤› gibidir. Fakat 

indirekt yöntemde basil süspansiyonunun 10 -3 ve 10 -5 dilüsyonlar› önerilmektedir. 

Bu dilüsyonlar› haz›rlamak için, McFarland no 1 bulan›kl›¤›ndaki basil 

süspansiyonundan 1ml’si 9 ml steril distile suya eklenir, bu ifllem seri dilüsyonlar 

fleklinde 5 kez tekrarlan›r ve 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 dilüsyonlar elde edilir. Her 

bir dilüsyondan sonra tüp vortekslenmelidir. Sonra 10 -3 ve 10 -5 dilüsyonlar› 

inokulasyon için kullan›l›r. 

‹nokulasyon ve ‹nkübasyon: 

• 10 -3 (1/1000) ve 10 -5 (1/100000) dilüsyonlardan, 2’fler adet ilaçs›z kontrol 

besiyerine ve 1’er adet ilaçl› besiyerlerine 0.2ml ekilir. Ekimler steril, tüberkülin 

enjektörü, otomatik pipet veya pastör pipeti ile yap›labilir. 

• Ekilen tüpler basillerin yüzeye yay›labilmesi için etüve yat›k olarak konulur. 

‹nokulumun buharlaflabilmesi için kapaklar hafifçe gevflek b›rak›l›r. 

• 24-48 saat sonra kapaklar s›k›ca kapat›l›p, 36±1ºC’de inkubasyona b›rak›l›r. 

Sonuçlar›n De¤erlendirilmesi: 

De¤erlendirme agar proporsiyon yönteminde anlat›lana benzer flekildedir. Basil 

dilüsyonunda amaç say›labilecek koloni elde etme esas›na dayan›r. ‹ndirekt 

testlerde bu dilusyon 10 -5 olabilece¤i gibi 10 -3 de olabilir. De¤erlendirmede de¤iflik 

tüplerdeki koloniler say›l›r, bu say›mlara göre dirençli basil oran› saptan›r. Ç›kan 

sonuçlar›n her biri o ilaç için saptanm›fl olan kritik proporsiyon ile karfl›laflt›r›p o 

ilaca karfl› duyarl› ya da dirençli oldu¤una karar verilir. LJ ile proporsiyon 

yönteminde farkl› olarak baz› primer ve sekonder ilaçlarda kritik proporsiyon 

%1’de¤il %10 olarak belirlenmifltir (tablo 6). 

59

DSÖ’ sonuçlar›n 28. ve 40. günlerde okunmas›n› önermifltir. DSÖ’nün bu rehberinde 

28. günde dirençli koloni oran› KP’dan yüksek ise dirençli olarak rapor 

edilebilece¤ini; yine 28. günde kontrol besiyerinde yeterli üreme olmas›na ra¤men, 

en yo¤un dilüsyon (10 -3 ) inokule edilmifl olan, ilac›n en düflük konsantrasyonundaki 

besiyerinde üreyen koloni yok ise duyarl› olarak rapor edilebilece¤ini; bu iki 

durum d›fl›ndaki tüm sonuçlar›n 40. günde de¤erlendirilmesi gerekti¤ini bildirmifltir. 

III. BACTEC 460 TB (radyometrik) ANT‹B‹YOT‹K DUYARLILIK TEST YÖNTEM‹ 

Prensip: Mikobakteriler antibiyotik içeren ve içermeyen Bactec 12B 

(Middlebrook 7H12) fliflelerine ekilir ve 37oC’de inkübe edilir. Kontrol fliflesine 

ekilen mikroorganizma say›s› ilaç içeren flifleye göre 100 kat azd›r. fiifleler günlük 

olarak Bactec 460 cihaz›nda okunur. Antimikobakteriyel inhibisyon olmad›¤›nda, 

mikobakteriler ürer ve besiyerindeki 14C iflaretli substrat› kullan›r. Böylelikle 

14CO2 oluflur ve Bactec 460 cihaz›nda Growth Index (GI) terimiyle kantitatif 

olarak ölçülür. Duyarl›l›k sonuçlar›, kontrol ve ilaç içeren fliflelerin günlük GI de¤eri 

art›fllar›n›n karfl›laflt›r›lmas›yla yorumlan›r. Antitüberküloz ilaç içeren besiyerinde, 

duyarl› mikobakterilerin üremesi inhibe olur ve bu GI okumalar›yla kaydedilen 

günlük 14CO2 üretiminde artmama veya azalmayla sonuçlan›r. Mikobakteriler 

test edilen ilaca dirençliyse, üremenin inhibisyonu söz konusu olmayacak ve GI 

günlük olarak artacakt›r. Günlük GI de¤erindeki art›fl, test kültürünün dirençlilik 

derecesiyle orant›l›d›r. 

Tüberküloz basillerinin duyarl›l›k testi direkt veya indirekt yöntemle yap›labilir. 

Direkt testte, yayma pozitif ifllenmifl hasta örne¤i direkt olarak antibiyotikli ve 

antibiyotiksiz besiyerlerine ekilir. ‹ndirek testte ise, primer izolasyon besiyerinde 

üreyen mikroorganizman›n saf kültürü test edilir. 

‹ND‹REKT DUYARLILIK TEST YÖNTEM‹ 

Antibiyotik solüsyonlar›n›n haz›rlanmas›: 

Antibiyotikler (streptomisin, izoniazid, rifampin ve ethambutol) Bactec SIRE kiti 

olarak, liyofilize halde üretici firma taraf›ndan sa¤lanmaktad›r. Liyofilize halde 

bulunan bu ilaç flifleleri suland›r›larak stok solüsyonlar haz›rlan›l›r. 

60

• Liyofilize antibiyotik fliflelerinin kapa¤›n› alkollü pamukla silin. 

• Her liyofilize antibiyotik fliflesine 5 ml steril distile deiyonize su ekleyin ve 

tamamen çözünene kadar kar›flt›r›n. 

• Antimikrobiyal ajanlar›n dilüsyon flemas› ve Bactec 12B besiyerindeki son 

konsantrasyonlar› tablo 7’de görülmektedir. 

• Stok solüsyonlar ufak miktarlar halinde 2-8ºC’de 3 gün, -5 ila -20ºC aras›nda 

3 aya kadar, -70ºC’de 6 aya kadar saklanabilir. 

Antibiyotikli ve antibiyotiksiz 12B fliflelerinin haz›rlanmas›: 

• Her bir antibiyotik duyarl›l›k testi için befl adet Bactec12B fliflesi ve bir adet 

Bactec dilüsyon s›v›s› (DF) fliflesi haz›rlay›n. 

• Tüm fliflelerin üzerine hasta kültür numaras›n› yaz›n. 

• Befl adet 12B fliflesinin birine kontrol, dördüne ise çal›fl›lacak dört antibiyoti¤in 

ismini yaz›n (S,I,R,E ve K) 

• SM ve EMB’nin daha önce haz›rlanm›fl olan stok solüsyonlar›n›n 1ml’si aseptik 

flartlarda 2ml steril distile su içine ilave edilerek 1/3 dilüe edin. 

• Her birinin üzerinde antibiyoti¤in ismi yazan dört ayr› Bactec 12B fliflesine, 

INH ve RIF için direkt stok solüsyondan, SM ve EMB için dilüe edilmifl stok 

solüsyondan 0.1ml.yi, tek kullan›ml›k tüberkülin enjektörüyle ekleyin. Her ilaç 

için ayr› bir enjektör kullan›n. 

• Kontrol fliflesine herhangi bir antibiyotik eklemeyin. 

• Hiçbir zaman 12B fliflesine 0.1ml’den fazla miktarda antibiyotik solüsyonu 

eklemeyin. Daha yüksek konsantrasyonlarda çal›flmak isterseniz antibiyotik stok 

solüsyonunu daha yüksek konsantrasyonda haz›rlayabilirsiniz. Böylece 12B’ye 

ilave edece¤iniz miktar yine 0.1ml olarak kalmal›d›r. 

• Antibiyotik eklenen 12B fliflesi 2-8ºC’de saklanarak 7 gün içinde kullan›labilir. 

‹nokulum haz›rlanmas›: 

‹ndirekt duyarl›l›k test yönteminde, laboratuvar›n kapasitesi ve çal›flma flekline 

göre günlük (haftan›n 7 günü) veya hafta içi (hafta sonu dahil olmayan) iki ayr› 

program vard›r. Bu iki programda inokulasyon yo¤unlu¤u, inkübasyon süresi ve 

fliflelerin okutulmas›nda farkl›l›klar vard›r. 

‹ndirekt duyarl›l›k test yönteminde inokulum haz›rlarken örnek olarak Bactec 

12B besiyeri, di¤er bir s›v› besiyerleri (MiddleBrook7H9 gibi) veya bir kat› 

besiyerlerinde (LJ, M7H10 veya M7H11) üremifl saf kültürler kullan›labilmektedir. 

61

Pozitif Bactec 12B fliflesinden inokulum haz›rlanmas›; 

• E¤er primer izolasyon fliflesi kullan›lacaksa, GI de¤eri 10’un üzerine ç›kt›¤›nda 

flifleleri günlük olarak test ederek, GI de¤erinin >500 olmas›n› bekleyin ve bunu 

inokulum olarak kullan›n veya GI 300 olunca bir gün daha inkübe edin ve inokulum 

olarak kullan›n. 

• E¤er 12B fliflesine subkültür yap›ld›ysa, ayn› flekilde GI de¤eri >500 olana kadar 

flifleleri günlük olarak okutun. 

• GI de¤eri >800 ise, 1ml pozitif kültürü 1ml DF içine ekleyerek dilue edin ve 

bunu inokulum olarak kullan›n. 

• E¤er hafta sonu dahil olmayan program uygulan›yorsa, GI de¤eri 500’ü geçen 

flifleyi buzdolab›nda cumaya kadar saklay›n (1 hafta içinde kullan›n). 

MiddleBrook 7H9 besiyerindeki üremeden inokulum haz›rlanmas›; 

Besiyerinin bulan›kl›¤›n› DF ile hafta sonu dahil olmayan program için McFarland 

0.5’e, günlük program için McFarland 1.0’e ayarlay›n, inokulum olarak kullan›n. 

(kültür 1–4 haftal›k olmal›d›r) 

Kat› besiyerindeki üremeden inokulum haz›rlanmas›; 

Üreme saptand›ktan sonra 4 haftadan uzun süre geçmemifl kültürler kullan›lmal›d›r. 

• Kat› besiyerinde üremifl koloniler sert bir öze yard›m›yla kaz›narak al›n›r ve 

içinde 6–8 adet cam boncuk bulunan 3 ml DF’de emulsifiye edilir. 

• 1–2 dakika süreyle vortekslenir. 

• Büyük partiküllerin çökmesi için 30 dk süreyle tüp bekletilir. 

• Süpernatant steril pastör pipeti yard›m›yla bofl bir steril cam tüpe al›n›r. 

• Bu süspansiyonun üzerine DF ekleyerek bulan›kl›¤›n›, hafta sonu dahil olmayan 

program için McFarland 0.5’e, günlük program için McFarland 1.0’e ayarlay›n. 

‹nokulasyon ve inkübasyon; 

• Antibiyotik duyarl›l›k testlerinde kullan›lacak tüm 12B fliflelerini Bactec 460 

cihaz›nda test ederek fliflelerin içinde % 5’lik CO2 ortam› sa¤lay›n. 

• Dört adet antibiyotikli, bir adet antibiyotiksiz kontrol besiyerini ve bir adet 

Bactec DF fliflesini s›ralay›n. 

• fiiflelerin lastik kapaklar›n› alkollü pamukla silerek dezenfekte edin. 

• ‹nokulum süspansiyonunu iyice kar›flt›r›n ve bir tüberkülin enjektörü ile ilaç 

içeren dört adet 12B fliflesine 0.1ml inokule edin. 

62

• Ayr›ca yine 0.1ml bu süspansiyondan 9.9ml DF fliflesine ekleyin ve kar›flt›r›n. 

Böylece standardize edilmifl inokulum süspansiyonunu DF ile 1/100 oran›nda dilue 

edin. 

• DF ile 1/100 oran›nda dilue edilmifl süspansiyondan 0.1ml’yi kontrol fliflesine 

inokule edin. 

• Birkaç damla inokulum süspansiyonunu, bir adet kanl› agar ve bir adet M7H10 

veya M7H11 agar pla¤›na subkültüre edin. 

• Her fliflenin lastik kapa¤›n› dezenfektan emdirilmifl pamukla ve peflinden 

alkollü pamukla silin 

• fiifleleri 37±1ºC’de karanl›kta inkübe edin. 

Sonuçlar›n okunmas›: 

Sonuçlar› okumadan önce kanl› agar ve M7H10 veya M7H11 plaklar›n› 

kontaminasyon yönünden inceleyin. Kontaminasyon saptanmaz ise günlük ya 

da hafta sonu dahil olmayan programa göre sonuçlar› okuyup, sonuçlar› kay›t 

formuna iflleyin. 

Günlük programda; 

• fiifleleri hafta sonu ve tatiller dahil olmak üzere günlük olarak okutun. 

• Her gün yaklafl›k olarak ayn› saatte (±2 saat) okutun. 

• En az 4 gün okutun. 

• Kontrol fliflesinin GI de¤eri >30 ise sonuçlar yorumlanabilir. 

• Kontrol fliflesinin GI de¤eri bir iki gün içinde >30 olursa, muhtemelen inokulum 

çok yo¤undur. Testi tekrar edin. 

• Kontrol fliflesinin GI de¤eri 3. okutmada >30 olursa, sonuçlar› yorumlamadan 

önce bir gün daha inkübe edin. 

• Kontrol fliflesinin GI de¤eri 14 günlük inkübasyondan sonra 30’a ulaflmazsa, 

testi tekrar edin. 

Hafta sonu dahil olmayan programda; 

• Testi Cuma günü yap›n. 

• Pazartesinden itibaren günlük ve yaklafl›k olarak her gün ayn› saatte (±2 saat) 

okutun 


• Kontrol fliflesinin GI de¤eri Pazartesi günü >30 olursa, muhtemelen inokulum 

çok yo¤undur. Testi tekrar edin. 

63

• Sal› günü kontrol fliflesinin GI de¤eri >30 olursa, çarflamba günü de okuttuktan 

sonra, sonuçlar› yorumlay›n. Pazartesi gününe ait GI de¤erini dikkate almay›n. 

• Kontrol fliflesinin GI de¤eri 14 günlük inkübasyondan sonra 30’a ulaflmazsa, 

testi tekrar edin. 

Yorumlama: 

• Kontrol ve ilaç içeren fliflelerin, bir gün önceyle karfl›laflt›rarak, günlük GI 

farkl›l›klar›n› ( GI) hesap edin. 

• Sonuçlar› afla¤›daki gibi yorumlay›n; 

Kontrol fliflesinin GI > ilaçl› fliflenin GI = duyarl› 

Kontrol fliflesinin GI < ilaçl› fliflenin GI = dirençli 

Kontrol fliflesinin GI ilaçl› fliflenin GI = s›n›rda veya k›smi dirençli 

• ‹laç içeren fliflenin GI de¤eri 500’ü geçer ve bir sonraki gün de 500’ün üzerinde 

kal›rsa, GI’e bakmaks›z›n, sonucu dirençli olarak yorumlay›n (kontrol fliflesinden 

inokulumun yo¤un olmad›¤›n› kontrol ederek inokulumun yo¤un olmad›¤›ndan 

veya bir kontaminasyon olmad›¤›ndan emin olun). 

• S›n›rda sonuçlar söz konusuysa, flifleleri ek olarak 2–3 gün daha okutun. Bu 

ek okumalar duyarl› veya dirençli yönünde bir trendin yakalanmas›na neden 

olacakt›r. 

Kalite kontrol; 

Her antibiyotik duyarl›l›k test gününde M.tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) kalite 

kontrol suflunu da test edin. Bu sufl test sonucunda tüm primer ve sekonder 

antitüberküloz ilaçlara karfl› duyarl› olmal›d›r. M.tuberculosis H37Rv içeren kontrol 

fliflesi 3–5 gün içinde 30’dan büyük bir GI de¤erine ulaflmal›d›r. Kalite kontrol 

suflunun sonuçlar› uygun de¤ilse, afla¤›daki parametreleri gözden geçirin. 

Kontrol fliflesinin GI 30 de¤erine ulaflmas›nda gecikme varsa; 

• ‹nkübasyon ›s›s›n›n 37±1ºC oldu¤undan, 

• Suflun canl›l›¤›ndan, 

• ‹nokulum dilüsyonunun do¤ru yap›ld›¤›ndan emin olun. 

M.tuberculosis H37Rv her hangi bir ilaca dirençli bulunursa; 

• Tam dirençliyse, besiyerinde antibiyotik olmayabilir veya kontamine olmufl 

olabilir. 

• K›smi dirençliyse, antibiyotik aktivitesini kaybetmifl olabilir veya inokulum 

çok yo¤un olabilir. 

64

D‹REKT DUYARLILIK TEST YÖNTEM‹ : 

ARB yayma pozitif tüm hasta örneklerine uygulanabilir. Hasta örne¤indeki basil 

say›s›na ba¤l› olarak 4–21 gün içinde sonuç verir. Primer izolasyon besiyeriyle 

ayn› gün ekim yap›l›r. Tüm direkt test sonuçlar› indirekt testle do¤rulanmal›d›r. 

• Sadece izoniazid, rifampin, streptomisin ve ethambutolü test edin. 

• ‹nokulasyon öncesi kontrol ve antibiyotik içeren fliflelere 0.1ml Bactec PANTA 

(Polimiksin B, Amfoterisin B, Nalidiksik asit, Trimetoprim ve Azlosilin) antibiyotik 

kar›fl›m› ekleyin. 

• Homojenize, dekontamine ve konsantre edilmifl, ARB’si pozitif, iyice kar›flt›r›lm›fl 

primer hasta örne¤inin 0.1ml.sini antibiyotik içeren dört adet 12B fliflesine direkt 

olarak inokule edin. 

• Ayr›ca hasta örne¤ini DF s›v›s›yla 1:10 dilue edip iyice kar›flt›rd›ktan sonra, 

0.1ml kontrol fliflesine inokule edin. (genellikle örnek az say›da basil içerdi¤inden 

inokulumun 1/100 yerine 1/10 dilüsyonu tercih edilir) 

• Her 2–3 günde bir okutarak, 37±1ºC’de üç haftaya kadar inkübe edin (yayma 

pozitifli¤i yüksek düzeyde olan örnekleri her gün okutun). 

• Kontrol fliflesinin GI de¤eri > 10 oldu¤unda, flifleleri her gün okutun 

• Kontrol fliflesinin GI de¤eri > 20 oldu¤unda, sonuçlar› yorumlay›n. 

• Kontrol fliflesinin GI de¤eri 21 günlük inkübasyonla >20 olmaz ise, testi 

yorumlamay›n. 

• ‹nokulumdaki mikobakteri say›s› daha az ve inkübasyon süresi daha uzun 

oldu¤undan genellikle sonuçlar daha bariz olarak duyarl› veya dirençlidir. ‹laçl› 

flifledeki GI’in, kontrol fliflesindeki GI’e yak›n olmas› (%20 içinde), kontrol 1/10 

dilüe edilmifl oldu¤undan, %10 dirençli populasyonu düflündürür. 

• Rapora “sonuçlar, direk hasta örne¤inin test edilmesiyle elde edilmifltir” 

fleklinde bir not koyun. 

• ‹zolat›n tüberküloz basili oldu¤u do¤rulanmadan, duyarl›l›k test sonuçlar›n› 

rapor etmeyin. 

• Kalite kontrol için, indirekt testte belirtilenler direkt testte de geçerlidir. 

BACTEC 460 PZA (P‹RAZ‹NAM‹D) DUYARLILIK TEST‹ 

Pirazinamid (PZA), tüberküloz basillerine karfl› sadece düflük pH’da aktif olan bir 

antimikrobiyal ajand›r. Bactec PZA yönteminde, test pH 6.0’da yap›l›r. 

PZA solüsyonunun haz›rlanmas›: 

• Bactec Liyofilize PZA, 5 ml Bactec Reconstituting Fluid (RF) ile suland›r›l›r 

(4.000 μg/ml). 

• PZA stok solüsyonu ufak miktarlara bölünüp, S‹RE stok solüsyonlar› gibi 

saklanabilir. 

65

PZA içeren besiyerinin ve kontrol besiyerinin haz›rlanmas›: 

• Bactec PZA duyarl›l›k test besiyerine, RF ile suland›r›lm›fl olan PZA solüsyonundan 

tüberkülin enjektörü ile 0.1ml, eklenir (pH 6.0) (final PZA konsantrasyonu 100 

μg/ml). 

• Kontrol besiyerine Bactec RF s›v›s›ndan 0.1ml eklenir. (RF üremeyi kolaylaflt›r›c› 

bir madde olan POES (polyoxyethylene sterearate) içerir, bu nedenle inokule 

edilecek tüm fliflelerde bu RF bulunmal›d›r. 


• Afla¤›da belirtilen besiyerlerinden herhangi birindeki üremeden 0.1ml’yi, 

0.1ml Bactec RF eklenmifl Bactec 12B besiyerine subkültüre edin. 

- GI de¤eri 300-999 aras› olan Bactec 12B besiyeri 

- Bulan›kl›¤› McFarland no1 veya daha düflük olan M7H9 besiyeri 

- Kat› besiyerinden haz›rlanm›fl ve bulan›kl›¤› McFarland no1’e yak›n süspansiyon 

• Karanl›kta 37±1ºC’de inkübe edin. 

• Subkültürü günlük olarak okutun. 

- GI 300-500 aras›nda ise, bunu inokulum olarak kullan›n. 

- GI>500 ise afla¤›daki gibi dilue edin. 

a) GI 500-599 ise, 1.0ml 12B besiyeri ekleyin. 

b) GI 600-699 ise, 1.5ml 12B besiyeri ekleyin. 

c) GI 700-799 ise, 2.0ml 12B besiyeri ekleyin. 

d) GI 800-899 ise, 2.5ml 12B besiyeri ekleyin. 

e) GI 900-999 ise, 3.5ml 12B besiyeri ekleyin. 

- Pik GI de¤erine ulaflt›ktan sonra veya GI 999 okunduktan sonra 1 günden 

fazla geçen kültürleri inokulum olarak kullanmay›n. 

‹nokulasyon ve inkübasyon: 

• Tüm fliflelerin lastik kapa¤›n› %70’lik alkolle silin. 

• ‹nokulum süspansiyonunu iyice kar›flt›r›n ve bir tüberkülin enjektörü ile PZA 

içeren flifleye ve kontrol fliflesine 0.1ml inokule edin. Kontrol fliflesi için inokulumu 

dilüe etmeyin. 

• Birkaç damla inokulum süspansiyonunu bir adet kanl› agar ve bir adet M7H10 

veya M7H11 agara, inokulumun saf olup olmad›¤›n› kontrol etmek için, inokule 

edin. 

66

• 37±1ºC’de karanl›kta inkübe edin. 

Sonuçlar›n okunmas›: 

• Kanl› agar ve M7H10 veya M7H11 plaklar›n› kontaminasyon yönünden 

inceleyin. 

• fiifleleri günlük olarak okutun. 

• Her gün yaklafl›k olarak ayn› saatte (±2 saat) okutun. 


• Kontrol fliflesinin GI de¤eri 200 ise, sonuçlar yorumlanabilir. 

• Kontrol fliflesinin GI de¤eri 14 günlük inkübasyondan sonra 200’e ulaflmazsa, 

testi yorumlamay›n. 

Not: Hafta sonu dahil olmayan program kullan›lacaksa S‹RE için kullan›lan 

programa benzer flekilde test Cuma günü yap›l›r, pazartesi gününden itibaren 

okutulmaya bafllan›l›r. 

Yorumlama: 

Sonuçlar› afla¤›daki gibi yorumlay›n; 

• PZA fliflesinin GI < kontrol fliflesinin GI’inin % 10 = duyarl› 

• PZA fliflesinin GI > kontrol fliflesinin GI’inin % 10 = dirençli 

Direnci gösteren sonuçlar 4 günden önce yorumlanabilir, fakat duyarl›l›¤› gösteren 

sonuçlar 4 günden önce raporlanmamal›d›r. 

Kalite kontrol: 

M.tuberculosis H37Rv suflunun üreme kontrolü 3–8 gün içinde GI > 30 de¤erine 

ulaflmal›d›r ve PZA’ya tamamen duyarl› olmal›d›r. 

IV. BACTEC MGIT 960 S‹STEM‹ ‹LE DUYARLILIK TEST‹ 

Prensip: 

BACTEC MGIT 960 SIRE kiti kültürde izole edilen M.tuberculosis’i test etmek için 

nonradyometrik bir duyarl›l›k testidir. BBL MGIT 7-ml mycobacteria growth 

indicator tube (MGIT tube) mikobakterilerin üremesini ve saptanmas›n› sa¤layan 

modifiye Middlebrook 7H9 broth içerir. MGIT tüpün dibindeki silikon içine floresan 

madde gömülüdür. Floresan madde s›v› besiyerinde çözülmüfl oksijen varl›¤›na 

67

duyarl›d›r. Çözülmüfl oksijenin bafllang›çtaki konsantrasyonu floresan maddeden 

floresans yay›l›m›n› bask›lar. Üreyen mikroorganizmalar oksijeni tüketir ve floresan 

maddenin floresans yaymas›na neden olur. 

BACTEC MGIT 960 SIRE kiti 4–13 günde sonlanan kalitatif bir testtir. Test 

M.tuberculosis izolatlar›n›n ilaçl› ve ilaçs›z tüplerdeki üremelerinin karfl›laflt›r›lmas› 

esas›na dayan›r. MGIT 960 cihaz› tüplerdeki floresans art›fl›n› sürekli izler. Cihaz 

yard›m›yla ilaçl› ve ilaçs›z tüplerdeki floresans analizleri karfl›laflt›r›larak duyarl›l›k 

sonuçlar› belirlenir. BACTEC MGIT 960 cihaz› otomatik olarak bu sonuçlar› yorumlar 

ve duyarl› ya da dirençli olarak bildirir. 


Antibiyotikler (streptomisin, izoniazid, rifampin ve ethambutol) Bactec MGIT 

SIRE kiti içinde liyofilize halde üretici firma taraf›ndan sa¤lanmaktad›r. Liyofilize 

halde bulunan bu ilaç flifleleri suland›r›larak stok solüsyonlar haz›rlan›l›r. 

• Liyofilize antibiyotik fliflelerinin kapa¤›n› alkollü pamukla silin. 

• Her liyofilize antibiyotik fliflesine 4 ml steril distile su ekleyin ve tamamen 

çözünene kadar kar›flt›r›n. 

• Liyofilize antibiyotiklerin dilüsyon flemas› ve BBL MGIT 7ml besiyerindeki final 

konsantrasyonlar› tablo 8’de görülmektedir. 

• Özellikle INH için olmak üzere, e¤er bir ilac›n kritik konsantrasyonunda direnç 

görülürse, ilac›n daha yüksek bir konsantrasyonu için duyarl›l›k testi yap›lmas› 

önerilmektedir. Bu amaçla BACTEC MGIT SM 4.0 ve INH 0.4 kitleri mevcuttur. Bu 

konsantrasyonlarda da duyarl›l›k testi yap›lacaksa; bu iki kitteki liyofilize ilaçlar 

2ml steril distile su ile suland›r›lmal›d›r tablo 8. Di¤er prosedür SIRE kiti ile 

benzerdir. 

Antibiyotikli ve antibiyotiksiz MGIT tüplerinin haz›rlanmas›: 

• Her test izolat› için 5 tane MGIT tüpünü al›n ve üzerlerini yaz›n (birine GC 

(Kontrol), di¤erlerine S, I, R ve E olarak). Tüpleri uygun büyüklükte AST (antibiyotik 

duyarl›l›k testi) set tafl›y›c›s›na do¤ru s›rayla yerlefltirin (soldan ilk tüp GC, sonra 

SIRE). 

• Her tüpe aseptik flartlarda 0.8ml BACTEC MGIT SIRE suplementi ekleyin. Kitin 

içinden ç›kan suplementin kullan›lmas› önemlidir. 

68

• Dört SIRE tüpünün her birine, üzerine yazd›¤›m›z antibiyotik ad›na uygun 

flekilde, daha önce haz›rlad›¤›m›z antibiyotik solüsyonlar›ndan bir mikropipet 

yard›m› 100μl pipetleyin (tablo 8). 

• Kontrol (GC) tüpüne hiçbir antimikrobiyal ajan eklemeyin. 

‹nokulum haz›rlanma: 

MGIT yöntemi ile duyarl›l›k testleri M.tuberculosis’in saf kültürlerinden yap›l›r 

Kat› besiyerinden ‹nokulum haz›rlanmas›; 

• Cam boncuklu steril bir tüpe 4 ml Middlebrook 7H9 veya MGIT broth koyun. 

• Steril bir öze ile olabildi¤ince çok koloniyi kaz›yarak al›n ve 7H9 içinde süspanse 

edin. 

• Büyük kümeleri da¤›tmak için süspansiyonu 2–3 dakika vorteksleyin. 

Süspansiyon bulan›kl›l›¤› McFarland no1 standard›n› geçmelidir. 

• Süspansiyonu 20 dakika bekletin. 

• Süpernatant› baflka bir kapakl› steril tüpe aktar›n, 15 dk. daha bekletin. 

• Süpernatant› yine baflka bir kapakl› steril tüpe aktar›n ve süspansiyonu 

McFarland no:0.5 standard›na göre ayarlay›n. 

• Ayarlanm›fl süspansiyonun 1 ml’sini 4 ml steril serum fizyolojikte dilüe edin 

(1/5 dilüsyon) 

Pozitif MGIT tüpünden inokulum haz›rlanmas›; 

• Pozitif bir MGIT tüpü, MGIT 960 cihaz›nda pozitif olduktan sonraki gün (1.gün) 

dahil 5. güne kadar kullan›labilir. 

• Tüpün 5 günden daha fazla bir pozitifli¤i varsa, Growth suplement eklenmifl 

yeni bir MGIT tüpüne subkültürü yap›lmal› ve pozitif oluncaya kadar cihazda test 

edilmeli, pozitifli¤i takip eden 1–5. günlerde kullan›lmal›d›r. 

• Tüpler 1–2 gündür pozitifse iyice kar›flt›r›l›p, inokulum olarak kullan›l›r. 

• Tüpler 3–5 gündür pozitifse iyice kar›flt›r›l›r, 1ml’si 4ml SF’de dilüe edilir ve 

bu 1/5 dilüe süspansiyon inokulum olarak kullan›l›r. 

‹nokülasyon: 

• Dört adet ilaçl› MGIT tüpünün her birine (S,I,R,E) inokulum süspansiyonundan 

0.5ml pipetleyin. 

• 1/100’lük kontrol süspansiyonu haz›rlamak için 9.9ml steril SF içine 0.1ml 

organizma süspansiyonu pipetleyin ve iyice kar›flt›r›n. 

69

• 1/100’lük kontrol süspansiyonundan “GC” olarak etiketlenmifl MGIT tüpüne 

0.5ml pipetleyin. 

• Tüm tüpleri s›k›ca kapat›n. 3–4 kez hafifçe alt üst ederek kar›flt›r›n. 

• MGIT 960 cihaz›na girifl kayd›n› yap›n (BACTEC MGIT 960 cihaz› kullan›m 

k›lavuzuna göre) 

• ‹nokulum süspansiyonundan kanl› agara 0.1ml ekin, 35-37 oC’de inkübe edin. 

• Bakteriyel kontaminasyon aç›s›ndan kanl› agar pla¤›n› 48. saatte kontrol edin. 

Kanl› agar pla¤›nda üreme yoksa teste devam edin, üreme varsa AST (Antibiyotik 

Duyarl›l›k Testi) setini at›n ve testi tekrar edin. 

Sonuçlar›n yorumlanmas› ve rapor edilmesi: 

• ‹laçl› tüpteki floresans kontrol tüpündekinden daha az oldu¤unda, MGIT 960 

cihaz› sonucu duyarl› olarak yorumlar. 

• ‹laçl› tüpteki floresans kontrol tüpündekine eflit oldu¤unda, cihaz sonucu 

dirençli olarak yorumlar. 

• MGIT 960 cihaz›n›n yorumu esas al›narak sonuç “duyarl›” veya “dirençli” 

olarak rapor edilir. 

• Test sonucunun etkilenebilece¤i baz› durumlar oldu¤unda, duyarl›l›k yorumu 

olmaks›z›n cihaz sonucu hata (X) olarak verir. Bu durumda sonuç rapor edilmez. 

• Raporda test yöntemi, ilaç ve konsantrasyonlar bulunmal›d›r. 

Uyar›lar: 

• BACTEC MGIT 960 duyarl›l›k testi test edilen izolat›n duyarl›l›k derecesini 

yorumlamaz. Sonuçlar test edilen ilaç ve konsantrasyon için S (duyarl›) ya da R 

(dirençli) olarak rapor edilir. 

• STR, INH, RIF, EMB için BACTEC MGIT 960 SIRE testinde kullan›lan kritik 

konsantrasyonlar, yanl›fl duyarl› sonuçlardan kaç›nmak için, proporsiyon yönteminde 

kullan›lan konsantrasyonlardan biraz daha düflüktür. Önerildi¤i gibi daha yüksek 

konsantrasyonlarda da test etmek izolat›n düflük düzey direncini saptama olas›l›¤›n› 

art›racakt›r. 

• BACTEC MGIT 960 duyarl›l›k testi sadece BACTEC MGIT 960 cihaz› ile 

uygulanabilir. AST seti manuel olarak okunamamaktad›r. M.tuberculosis’in sadece 

saf kültürü kullan›lmal›d›r. Kontamine olan veya çok say›da mikobakteri 

70

türü içeren kültürler yanl›fl sonuçlar verebilir ve test edilmemelidir. Klinik 

örneklerden direkt test önerilmemektedir. Kat› besiyerinden yap›lan süspansiyonlar 

standardize edilmeden çöktürmek için bekletilmelidir. Kat› besiyerinden haz›rlanan 

inokulum görsel olarak McFarland no: 0.5 bulan›kl›k standart›na ayarlanmal›d›r; 

bu yap›lmad›¤›nda yanl›fl sonuçlar al›nabilir veya cihaz hata verebilir. 

• ‹laçl› tüplere ve kontrol tüpüne inokule edilen organizma süspansiyonunun 

yukar›da önerilen dilüsyonlar› kullan›lmad›¤›nda yanl›fl sonuçlar verebilir. 

• ‹laçlar›n uygun volümde steril distile su ile suland›r›lmamas› yanl›fl sonuçlar 

verebilir. 

• ‹nokule edilen tüplerin iyice kar›flt›r›lmas› önemlidir. Tüplerin yeterince 

kar›flt›r›lmamas› yanl›fl dirençli sonuçlara yol açabilir. 

• AST set rak›na AST setinin do¤ru s›ra ile konulmamas› hatal› sonuçlar verebilir. 

‹laç tan›m›na uygun AST set rak›n›n seçilmemesi geçersiz veya yanl›fl sonuçlarla 

sonuçlanabilir. 

• AST setinin cihaz içine do¤ru flekilde yerlefltirilmemesi bir isimsiz durum olarak 

sonuçlanacakt›r, 8 saat içinde sorun çözülmelidir. Sorun 8 saatde çözülmez ise, 

AST seti at›lmal› ve test tekrar edilmelidir. 

AST setinde SIRE suplementi kullan›lmamas› yanl›fl sonuçlar verebilir. AST setine 

BACTEC MGIT 960 growth suplementi eklemeyin. 

Kalite kontrol: 

• MGIT 960 SIRE kit fliflelerinin gelen her yeni parti veya lot numaras›nda, 

M.tuberculosis ATCC 27294 kalite kontrol (QC) sufllar› test edilmelidir. Ayr›ca 

duyarl›l›k testi yap›laca¤› her hafta ayn› kalite kontrol sufllar› çal›fl›lmal›d›r. 

• Kalite kontrol stok sufllar› -70oC’de saklan›r. 

• Kalite kontrol testi, test edilecek ilaç kitleri için “duyarl›l›k test prosedürü” 

aç›klamalar›na uyularak uygulanmal›d›r. 

• 4–13 gün içinde kalite kontrol suflu GC tüpünde pozitif sonuç vermeli ve tüm 

antibiyotiklere duyarl› olmal›d›r. Uygun sonuçlar al›nmaz ise test tekrar edilir. 

BACTEC MGIT 960 PZA (P‹RAZ‹NAM‹D) DUYARLILIK TEST‹ 

Prensip: 

BACTEC MGIT 960 PZA kiti de SIRE kiti ile benzer prensiple çal›flan, pirazinamid 

(PZA) duyarl›¤›n› 4–21 günde test eden kalitatif bir testtir. PZA testi genel 

71

yöntemlerin modifikasyonunu gerektirir, çünkü PZA in vitro sadece daha düflük 

pH de¤erlerinde aktiftir. MGIT 960 PZA besiyeri, pH’› 5.9’a düflürülmüfl modifiye 

Middlebrook 7H9 broth içerir. 


BACTEC MGIT 960 PZA kiti içinden ç›kan liyofilize PZA, daha önce anlat›lan MGIT 

SIRE duyarl›l›k testindeki gibi suland›r›l›r. Tek fark suland›r›m için 2.5ml distile 

su kullan›lmas›d›r (tablo 8). 

Antibiyotikli ve antibiyotiksiz MGIT tüplerinin haz›rlanmas›: 

• Her test izolat› için 2 tane BACTEC MGIT PZA tüpünün üzerini “GC” ve “PZA” 

olarak yaz›n. Tüpleri iki tüplük AST tafl›y›c›s›na do¤ru s›rayla yerlefltirin (firma 

önerilerine göre). 

• Her tüpe aseptik flartlarda 0.8ml BACTEC MGIT PZA suplementi ekle. Do¤ru 

suplementin kullan›lmas› önemlidir. 

• Bir mikropipet kullanarak, aseptik flartlarda, etiketine uygun MGIT tüpüne 

(PZA) 8.000μg/ml’lik MGIT PZA’dan 100μl pipetleyin. 

• Kontrol tüpüne antimikrobiyal ajan eklemeyin. 


MGIT SIRE duyarl›l›k testinde anlat›ld›¤› gibidir. 

‹nokülasyon: 

‹laçl› tüplerin inokülasyonu MGIT SIRE duyarl›l›k testinde anlat›ld›¤› gibidir. Fakat 

kontrol tüpü için 1/100’lük de¤il 1/10’luk kontrol süspansiyonu haz›rlay›n. 1/10’luk 

kontrol süspansiyonu haz›rlamak için 4.5ml steril SF içine 0.5ml inokulum 

süspansiyonu pipetleyin, iyice kar›flt›r›n. “GC” olarak etiketlenmifl tüpe 1/10’lük 

kontrol süspansiyonundan 0.5ml pipetleyin. 

Tafl›y›c›da kontrol tüpünün pozisyonunun soldan ilk tüp oldu¤undan emin olun. 

AST setinin cihaza giriflini yaparken, iki tüplük AST set tan›m›nda ilaç olarak 

PZA’y› seçin. 

Sonuçlar›n yorumlanmas› ve rapor edilmesi: 

S‹RE yorumunun %1 proporsiyon düzeyinde yap›ld›¤› gibi, PZA’da direnç %10 

proporsiyon düzeyinde rapor edilir. 

72

Sadece PZA’ya direnç (Monoresistance) nadirdir. Sadece PZA direnci bulunmufl 

ise, M.tuberculosis’in safl›¤›n›, identifikasyonunu ve di¤er parametreleri kontrol 

ederek sonuçlar› do¤rulay›n. 

Uyar›lar: 

• PZA duyarl›l›k testinde NCCLS, referans yöntem olarak BACTEC 460TB yöntemini 

önermektedir. Nonradyometrik BACTEC MGIT 960 PZA kiti, BACTEC 460TB yöntemi 

ile yaklafl›k ayn› sürede duyarl›l›k sonucu vermektedir. Benzer sonuçlar elde 

edebilmek için MGIT 960 PZA kitinde, BACTEC 460TB’de oldu¤u gibi PZA’n›n 

100g/ml konsantrasyonu kullan›lmaktad›r. 

• Kat› besiyerindeki üreme taze olmal›d›r (14 günlük). Daha eski kültürlerden 

haz›rlanan; McFarland no 0.5 standard› kullan›lmadan haz›rlanan; uygun 

dilüsyonlarda haz›rlanmayan inokulumlar yanl›fl sonuçlar verebilir. 

• Kontrol tüpüne inokulasyon için izolat›n 1/10 dilüsyonunun kullan›lmamas› 

yanl›fl sonuçlar verebilir. 

• PZA AST setinde MGIT 960 PZA suplementi kullan›lmamas› yanl›fl sonuçlar 

verebilir. PZA AST setine MGIT 960 SIRE suplementi veya BACTEC MGIT 960 

growth suplement koymay›n. 

KAYNAKLAR 

1. Hacek D: Modified proportion agar dilution test for slowly growing 

mycobacteria. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Isenberg HD (Ed in 

Chief). ASM, Washington, D.C. 1992: 5.13.1–5.13.15. 

2. NCCLS. Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic 

Actinomycetes; Approved Standart. NCCLS document M24-A, Pennsylvania, 2003. 

3. Kent PT, Kubika GP. Public Health Mycobacteriology A Guide for the level 

III Laboratory-Diivision of laboratory training and consultation laboratory program 

office. Public Health Service-Centers for Disease Control, Atlanta 1985: 159-182. 

4. Gümüfllü F, Ceyhan ‹, Kocagöz T, Sönmez N. Tüberküloz laboratuvar 

rehberi.1.Bask›. Ankara: T.C. Sa¤l›k Bakanl›¤› Refik Saydam H›fz›ss›hha Merkez 

Baflkanl›¤›. 1998. 

5. WHO. Guidelines for drug susceptibility testing for second-line anti-tuberculosis 

drugs for DOTS-PLUS. WHO/CDS/TB/2001.288; World Health Organization, 2001. 

6. Siddiqi SH. Radiometric (Bactec) tests for slowly growing mycobacteria. Clinical 

Microbiology Procedures Handbook, Isenberg HD (Ed in Chief). American Society 

73

for Microbiology/Washington,D.C. 1992: 5.14.1–5.14.25. 

7. Siddiqi SH. BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual. Becton 

Dickinson and Company Maryland,USA, 1996. 

8. NCCLS: Antimycobacterial susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis; 

tentative standart. NCCLS document M24-T, vol 15, no 16, 1995. 

9. Della-Latta P. Mycobacteriology and Antimycobacterial Susceptibility Testing. 

‹n Clinical Microbiology Procedures Handbook, Isenberg HD (Ed in Chief), Second 

edition, ASM, Washington, D.C. 2004: 7.7.1–7.8.5. 

Tablo 1. Middlebrook 7H10 Agar besiyerine eklenmek üzere haz›rlanan ilk 

seçenek ilaçlar›n stok ve çal›flma konsantrasyonlar›, besiyerine eklenen miktarlar› 

ve besiyeri içindeki final konsantrasyonlar› 

Tablo 2. Middlebrook 7H10 Agar ile agar proporsiyon yönteminde ilaçl› ve ilaçs›z 

besiyerlerinin dört bölmeli petri plaklar›na dökülme düzeni ve ilaçlar›n 

konsantrasyonlar›. 

74

Tablo 3. Direkt test yönteminde inokulum dilüsyonu 

Tablo 4. Agar plaklar›ndaki mikobakteri kolonilerinin üreme yönünden 

kantitasyonu 

Tablo 5. Proporsiyon yönteminde LJ besiyerine eklenmek üzere haz›rlanan ilk 

seçenek ilaçlar›n stok ve çal›flma konsantrasyonlar›, besiyerine eklenen miktarlar› 

ve besiyeri içindeki final konsantrasyonlar› 

75

Tablo 6. Proprosiyon yönteminde Middlebrook 7H10 agar için ve LJ için önerilen 

Kritik Konsantrasyon (KK) ve Kritik Proporsiyonlar (KP). 

Tablo 7: Bactec 460TB duyarl›l›k testinde liyofilize antibiyotiklerden stok solüsyon 

haz›rlama ve 12B besiyerindeki final antibiyotik konsantrasyonlar›. 

Tablo 8: MGIT liyofilize antibiyotiklerinin dilüsyon flemas› ve 7ml’lik MGIT tüpteki 

final konsantrasyonlar› 

76

Örnek: Agar proporsiyon testi kay›t formu 

Hasta ad› soyad› : ‹nokulasyon tarihi : 

Hasta no : Okuma tarihi : 

Örnek ad› : Test yöntemi : 

Örnek: BACTEC radyometrik duyarl›l›k testi kay›t formu 

Hasta ad› soyad› : ‹nokulasyon tarihi : 

Hasta no : ‹nokulum kayna¤› : 

Örnek ad› : ‹nok. GI de¤eri : 

Test yöntemi : 

Rapor tarihi : 

Okuma program›: 

(günlük/haftasonu hariç) 

77

TÜBERKÜLOZ TANISINDA KLAS‹K PCR: 

“PCR ve RFLP Yöntemleri ile Mycobacterium Türlerinin ‹dentifikasyonu” 

Prof.Dr. Ahmet SAN‹Ç 1 , Doç. Dr. Ahmet K‹Z‹RG‹L 2 

1 Kafkas Üniversitesi Rektörlü¤ü, Azerbaycan 

2 F›rat Üniversitesi T›p Fakültesi, Elaz›¤. 

Mikroskopi ve kültür gibi klasik tan› yöntemleri Mycobacterium’lara ba¤l› 

infeksiyonlar›n tan›s›nda önemini eskisi gibi korumakla birlikte daha uzun zaman 

almakta ve yeni etkenlerin tan›mlanmas›nda yetersiz kalabilmektedir. Moleküler 

yöntemler oldukça h›zl› olmalar› ve tan›mlama aral›klar›n›n geniflli¤i nedeniyle 

Mycobacterium infeksiyonlar›n›n tan›s›nda da yayg›n kullan›m alan› bulmufltur. 

Mycobacterium infeksiyonlar›n›n tan›s›nda kullan›lan moleküler yöntemlerin 

amac›, flu ana bafll›klar alt›nda toplanabilir: 

• Mycobacterium’lar›n klinik örneklerde varl›¤›n›n saptanmas›, 

• Klinik örneklerde bulunan veya kültürde üretilen bakterilerin türlerinin 

saptanmas› veya tiplendirilmesi, 

• Mycobacterium’lar›n antimikrobiyal ilaçlara karfl› dirençli olup olmad›klar›n›n 

araflt›r›lmas›, 

• Moleküler epidemiyolojik araflt›rmalar ile Mycobacterium infeksiyonlar›n›n 

kayna¤›n›n ortaya ç›kart›lmas›. 

POL‹MERAZ Z‹NC‹R REAKS‹YONU (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) 

PCR ilk defa Kary Mullis taraf›ndan 1985 y›l›nda tan›mlanm›flt›r (1). Bu yöntemde 

ço¤alt›lmas› (replikasyon) istenen DNA örne¤i, replikasyon için gereken maddelerle 

birlikte bir tüpe konarak, üç de¤iflik ›s›da bir döngü (siklus) içerisinde tutulur. 

• Denatürasyon: Polimeraz Zincir Reaksiyonu’nda ilk basamak DNA’n›n 

denatürasyonudur. 94-95°C'ye ›s›t›lan DNA'n›n iki zinciri birbirinden ayr›l›r. 

• Ba¤lanma (annealing): ‹kinci basamak ba¤lanmad›r Ortama konmufl ve sadece 

ço¤alt›lmak istenen DNA bölgesine özgül iki primer, s›cakl›¤›n (50-70°C'ye) 

düflürülmesiyle, ilk basamakta ayr›lm›fl olan kal›p DNA’n›n özgül olduklar› 

bölgelerine ba¤lan›rlar. 

78

• Uzama (ekstansiyon): Üçüncü basamak primerlerin uzamas›d›r. Ortama 

konmufl ve optimum sentez s›cakl›¤› 72-74 °C olan Thermus aquaticus (Taq) 

polimeraz› (ya da ›s›ya dayan›kl› baflka polimerazlar) bu ›s›da hedef DNA’ya 

yap›flm›fl primerlerin 3’ ucundan bafllayarak istenen DNA bölgesinin sentezini 

yapar. 

PCR Uygulamas›nda Karfl›lafl›lan Sorunlar 

• Yalanc› pozitif ve negatiflik 

• Deneyimli personel ve hassas çal›flma gerektirme 

• Uzun süre ve ifl yo¤unlu¤u 

• Özel laboratuar alt yap›s› ve ekipman gerektirme 

• Sonuçlar›n deneyimli kifliler taraf›ndan yorumlanmas› 

• Standardizasyon gereklili¤i 

• Maliyet 

RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP) 

Restriksiyon enzimlerinin (RE)’leri çift zincirli DNA dizisini belli nükleotit 

dizelerinden (ör. ATGC gibi) tan›yan ve kesen enzimlerdir. Günümüzde yaklafl›k 

1200 RE tan›mlanm›fl ve s›n›fland›r›lm›flt›r. S›n›fland›rmada ilk üç harf enzimin 

kayna¤› olan bakteriyi; romen rakamlar› da tan›mlanma s›ras›n› ifade eder. 

Örne¤in PvuI enzimi Proteus vulgaris’ten elde edilen ilk RE’ni ifade eder. 

RFLP tüm kromozomal DNA veya PCR sonras› elde edilen DNA’n›n RE’leri ile 

kesilerek DNA parçalar›n›n agaroz jelde büyüklüklerine göre ayr›ld›ktan sonra 

ethidium bromid ile boyanarak de¤erlendirilmesi esas›na dayan›r. 

UYGULAMA 

PCR ve RFLP YÖNTEMLER‹ ‹LE MYCOBACTERIUM TÜRLER‹N‹N ‹DENT‹F‹KASYONU 

Gereken Maddeler 

EDTA (Etilen diamin tetra asetik asit) 

Trizma Base 

Borik asit 

Sigma 

Sigma 

Sigma 

79

Chelex-100 

Sigma 

Standard agaroz 

Sigma 

NuSieve GTG agaroz 

FMC BioProduct 

Ethidium bromid 

Sigma 

Taq polimeraz (5 U/μl) 

Promega, Roche veya Fermentas 

dNTP 

Promega, Roche veya Fermentas 

Primer TB11: 5’-ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT-3’ 50 nmol 

Primer TB12: 5’-CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT-3’ 50 nmol 

Enjeksiyonluk distile su 

Eczac›bafl› ilaç 

Muhtelif Filtreli pipet uçlar›: 1-10, 10-100, 50-200 ve 100-1000 μl hacimlerinde 

Muhtelif Eppendorf tüpleri: 0.2 ml (ince cidarl›), 0.5 ml, (thermal cycler’da 

kullan›lacaksa ince cidarl›) ve 1.5 ml (yaz› yazmak için yan yüzleri pürüzlü) 

hacimlerinde 

Gereken Aletler 

Su banyosu veya kuru ›s›t›c› blok Nüve, Clifton veya di¤er markalar 

Vorteks 

Techne veya di¤er markalar 

Derin dondurucu (-20oC) 

Nuarie veya di¤er markalar 

Buzdolab› 2 adet (temiz ve kirli odada) -20 oC’lik bölmesi olan ve No frost de¤il 

Laminer hava ak›ml› kabin 

CB 1204, dan LAF veya yerli üretim 

Mikrosantrifüj 

en az 14.000 devir, so¤utmal› olabilir 

Thermal cycler 

Birçok üretici var 

Agaroz Jel Elektroforez Sistemi Birçok üretici var 

pH metre 


UV transilliminatör 


Mikrodalga f›r›n veya 

küçük elektrik ›s›t›c›s› 


Mikropipetler (1-10, 10-100, 50-200, 100-1000 l) Rainin, Biohit, Costar 

80

Çal›flman›n Üç Aflamas› Bulunmaktad›r: 

1. Mycobacterium DNA’s›n›n izole edilmesi: DNA izolasyon kiti kullan›lacakt›r. 

2. Mycobacterium DNA’s›n›n ço¤alt›lmas›: Spesifik 65 kilo daltonluk ›s› flok 

proteini (hsp65) bölgesinin PCR ile ço¤alt›lmas›: Tüberküloz basilleri kompleksi 

d›fl›ndaki mikobakterilerde de bu gen bulunur. Ancak Mikobakteri türleri aras›nda 

polimorfizm gösterir. 

3. Tüm mycobacterium’lara spesifik 65 kilo daltonluk ›s› flok proteini bölgesine 

ait PCR ürününün restriksiyon enzimleri ile kesilerek mycobacterium türlerinin 

identifikasyonu. 

I. Mycobacterium DNA’s›n›n ‹zole Edilmesi: 

Nükleik asitlerin hücrelerden ayr›larak, fiziksel ve/veya kimyasal ifllemlerden 

geçirilip saflaflt›r›lma ifllemi ekstraksiyon olarak tan›mlanmaktad›r. Bu ifllem 

esnas›nda nükleik asidlerin parçalanmaya karfl› korunmas›, amplifikasyon 

inhibitörlerinin ortamdan uzaklaflt›r›lmas› ve hedef nükleik asidin saflaflt›r›larak 

konsantre edilmesi amaçlanmaktad›r. De¤iflik ekstraksiyon yöntemleri 

gelifltirilmifltir: Fenol-kloroform yöntemi, distile suda kaynatma, deterjanlar + 

proteinaz K, de¤iflik kimyasallar›n kullan›m› (Chelex-100, Guanidium vb.) ve 

sonikasyon gibi yöntemler DNA ekstraksiyonu için kullan›lm›flt›r. Ayr›ca ticari 

olarak kullan›lan DNA/RNA ekstraksiyon kitleri mevcuttur. Mikobakterilerin DNA 

izolasyonu ekstraksiyon kitleri ile yap›lmas› planlanm›flt›r. 

II. Mycobacteriumlara spesifik hsp65 bölgesinin PCR ile ço¤alt›lmas›: 

DNA’n›n ço¤alt›labilmesi için PCR tepkime kar›fl›m›nda gerekli olan elemanlar : 

• DNA Extrakt›: Ekstraksiyonu yap›lm›fl, DNA ekstraksiyon kiti yard›m› ile 

amplifikasyona haz›r hale getirilmifl DNA örne¤idir. 

• Primer’ler: Ço¤alt›lacak bölgeyi sa¤dan ve soldan s›n›rlayan, ço¤alt›lmas› 

istenen bölgenin iki ucundaki DNA dizisini özgül olarak tan›y›p ba¤lanacak olan 

bir çift sentetik DNA parçalar›d›r. Primerler liyofilize halde geldi ise DNAz ve 

RNAz free distile suda 10 veya 50 pmol/μl olacak flekilde suland›r›l›r. Daha sonra 

küçük hacimlere (10-20 örneklik) bölünerek -20oC’de saklan›r. Tüm 

mycobacterium’lar›n PCR ile saptanmas› için primer TB11: 5’-ACC AAC GAT GGT 

GTG TCC AT-3’ ve TB12: 5’-CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT-3’ kullan›l›r . 

81

• dNTP Kar›fl›m›: Amplifikasyon esnas›nda denatüre edilen zincirlerin 

tamamlanmas›nda kullan›lacak olan deoksi nükleotit trifosfatlar (dNTP’ler: eflit 

oranda dATP, dGTP, dCTP, dTTP)’lardan oluflur. 100 mM konsantrasyonda olan 

stok dNTP’ler 10 defa DNAz ve RNAz free distile suda suland›r›larak küçük 

hacimlere (25-50 örneklik) bölünerek -20oC’de saklan›r. Suland›r›lan bu solüsyondan 

50 μl PCR kar›fl›m› için 1μl dNTP eklenir. 

• DNA Polimeraz: PCR çal›flmalar›n›n büyük ço¤unlu¤unda Thermus aquaticus 

(Taq) bakterilerinden elde edilen termostabil Taq DNA polimeraz enzimi 

kullan›lmaktad›r. Taq DNA polimeraz optimal s›cakl›kta (70-80oC) saniyede 35- 

100 nükleotidin polimerizasyonu ve 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesini gerçeklefltirme 

yetene¤ine sahiptir (1,16). Taq polimeraz genellikle 5 ünite/μl konsantrasyonda 

gelir ve -20oC’de saklan›r. 

• Tamponlar ve MgCl2: 10x PCR tamponunda 100 mM Tris ve 500 mM KCl 

bulunur. Taq DNA polimeraz MgCl2 varl›¤›nda etkindir. MgCl2’ün PCR’›n özgüllü¤ü 

ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vard›r. Genellikle optimum MgCl2 

konsantrasyonu olarak 1.5 mM tercih edilir. Düflük Mg+2 iyon konsantrasyonu 

zay›f ürün oluflumuna, yüksek Mg+2 iyon konsantrasyonu ise spesifik olmayan 

ürün oluflumuna sebep olmaktad›r. 10x PCR bufer ve MgCl2 (25 mM) genellikle 

Taq enzimi ile birlikte gelir ve afla¤›da belirtilen konsantrasyonda kullan›l›r. 

Yukar›daki kar›fl›m vortekslenerek kar›flt›r›ld›ktan sonra santrifüje edilir. Çal›fl›lacak 

82

örnek say›s›n›n çarp›m› kadar haz›rlanan kar›fl›m 45’er μl olarak örnek numaralar› 

yaz›lm›fl 0.2 veya 0.5 ml’lik (Thermal cycler’a ba¤l› olarak) eppendorf tüplerine 

da¤›t›l›r. Üzerine 5 μl Mycobacterium DNA’s› eklenerek thermal cycler aletine 

yerlefltirilir. Thermal cycler aletinde afla¤›daki siklus program› uygulan›r: 

Tüm Mycobacterium’lara Spesifik PCR Program›: 

94 oC’de 5 dk 1 siklus 

94 oC’de 1 dk 


72 oC’de 2 dk 


c) Agaroz Jel Elektroforezi: 

Amplifiye edilen PCR ürünleri de¤iflik yöntemlerle belirlenebilir. En yayg›n olarak 

kullan›lan› agaroz jel elektroforezidir. PCR ile elde edilen ürünler agaroz jel 

kullan›larak elektrik alan›nda büyüklü¤üne göre ayr›l›r. Agaroz jelde DNA 

bantlar›n›n görülebilmesi için PCR ürünlerinin flouresan bir boyayla (ör. Ethidium 

bromid) muamele edilmesi gerekir. Ethidium bromid’le boyanan DNA bantlar› 

ultraviyole (UV) transilliminatör veya epiilliminatör ›fl›¤› alt›nda görünür hale 

gelir. Beklenen PCR ürünlerinin varl›¤› DNA molekül a¤›rl›k standartlar› (DNA 

marker) veya pozitif kontroldeki bant büyüklü¤ü ile karfl›laflt›r›larak belirlenir. 

Beklenen PCR ürünü büyüklü¤üne göre agaroz konsantrasyonu afla¤›daki tablodan 

belirlenir. 

Tablo 2: Agaroz Konsantrasyonu ile DNA Ay›rma Gücü Aras›ndaki ‹liflki. 

83

PCR Ürününün Agaroz Jelde Yürütülmesi: 

• ‹lk olarak PCR ürününü büyüklü¤ü hesaplanarak kullan›lacak jelin agaroz 

yüzdesine karar verilir (Tablo). 200 ile 3000 baz çifti aras›ndaki bir ürün için % 

1.5’lik agaroz yeterlidir. 

• Önce agaroz ve terazinin bulundu¤u odaya girilir. Elektroforez tank›n›n 

büyüklü¤üne göre dökülecek jel miktar› belirlenir. Örnek: 40 ml’lik tank için; 0.6 

gram agaroz tart›l›p 40 ml 0.5X TBE tamponuna ilave edilir. 

• Stok 5X TBE bufer (50 gr Tris base, 27.5 gr Boric acid, 20 ml 0.5 M EDTA 

pH:8.0, 1 litre distile suda eritilir) on defa distile suda suland›r›larak 0.5X TBE 

bufer kullanma solüsyonu haz›rlan›r. 

• 40 ml 0.5X TBE bufer behere konulur. Üzerine tart›lan agaroz eklenerek 

kar›flt›r›l›r. 

• Mikrodalga f›r›nda 1 dakika 400 Watta tutulur. Mikrodalga yoksa ocak 

üzerinde arada bir kar›flt›r›larak agaroz eritilebilir. 

• Kar›flt›r›ld›ktan sonra so¤umas› için beklenirken agaroz jelin dökülece¤i plate 

haz›rlan›r. Örnek say›s›na göre 8’li veya 12’li tarak yerlefltirilir. 

• 50oC civar›na kadar so¤uyan 40 ml’lik agaroza 4 μl ethidium bromide (5 

mg/ml) eklenip kar›flt›r›ld›ktan sonra jel dökülür. 

• Jel donduktan sonra (yaklafl›k 30 dakika oda ›s›s›nda) plate’nin iki taraf›ndaki 

lastikler ve tarak ç›kar›l›r. 

• Her örnek için parafilm üzerine 2 μl yükleme solüsyonu (5x Loding bufer: 250 

mg Bromophenol blue, 3 ml gliserol, 7 ml distile su) konur. 10’ar μl PCR ürünü 

2 μl yükleme solüsyonu ile kar›flt›r›ld›ktan sonra s›rayla agaroz jele yüklenir. 

• 125 voltta 20 dakika veya 90 voltta 60 dakika elektroforez uygulan›r. 

• Elektroforez durdurulduktan sonra jel UV transilliminatörde incelenir. Beklenen 

bant görülen örnekler pozitif kabul edilir. Gerekirse poloroid foto¤raf makinas› 

veya jel dökümantasyon sistemi ile jeller foto¤ aflan›r. 

III. Tüm Mycobacterium’lara Spesifik 65 Kilo Daltonluk Is› fiok Proteini Bölgesine 

Ait PCR Ürününün Restriksiyon Enzimleri ile Kesilerek Mycobacterium Türlerinin 

‹dentifikasyonu (10) 

Uygun bant görülen (beklenen yerde ve yeterli yo¤unlukta) örneklerin 11’er μl’si 

HaeIII (BsuRI) ve BstEII (Eco91I) enzimleri ile kesilerek Mycobacterium türleri 

identifiye edilir. 

84

Tablo 4: BstEII ile PCR ürününün kesilmesi: 

• Enzim ve bufer kar›fl›mlar› örnek say›s›nca temiz odada haz›rland›ktan sonra 

0.2 veya 0.5 ml’lik eppendorf tüplerine 4’er μl olarak bölünür. 

• Daha sonra kirli odada üzerlerine 11’er μl PCR ürünü eklenir ve 37oC’de 4 

saat su banyosu veya thermal cycler’da tutulur. 

• Daha sonra Mycobacterium türlerinin identifikasyonu için restriksiyon enzimleri 

ile kesilen ve kesilmeyen ürünler birlikte %3’lük NuSieve GTG agaroz (FMC 

BioProduct)’da yürütülür. 

• PCR ürününün kesilmesi ile jel elektroforezde ortaya ç›kan bantlar›n bp 

uzunluklar› de¤erlendirilerek Mycobacterium türleri identifiye edilir (fiekil 1, 2) 

KAYNAKLAR 

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning A loboratory Manual. 

Third edition. CSHL Press, New York, 8.1-8.24. 

2. Diagnostic Standards and Classification of Tuberculosis in Adults and Children. 

This official statement of the American Thoracic Society and the Centers for 

Disease Control and Prevention was adopted by the ATS Board of Directors, July 

1999. This statement was endorsed by the Council of the Infectious Disease 

Society of America, September 1999. American Journal of Respiratory Critical 

85

Care Medicine, 161, 1376–1395. 

3. Durmaz R. Nükleik Asit Amplifikasyon Yöntemlerinde Sorunlar ve 

Standardizasyon. (2001). Uygulamal› Moleküler Mikrobiyoloji. Durmaz R (Eds.) 

2. Bask›. Kozan Ofset, Ankara, 45-56. 

4. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning A loboratory Manual. 

Third edition. CSHL Press, New York, 5.1-5.17. 

5. Hellyer TJ, DesJardin LE, Assaf MK, Bates JH, Cave MD, Eisenach KD. (1996). 

Specificity of IS6110-based amplification assays for Mycobacterium tuberculosis 

complex. J Clin Microbiol. 34:2843–2846. 

6. Gillespie, S. H., & McHugh, T. D. (1997). Monitoring the therapy of pulmonary 

tuberculosis by nested polymerase chain reaction. Journal of Infection, 35, 

324–325. 

7. Davies, A. P., Newport, L. E., Billington, O. J., & Gillespie, S. H. (1999). Length 

of time to laboratory diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection: 

comparison of in-house methods with reference laboratory results. Journal of 

Infection, 39, 205–208. 

8. Carrino, J. J., & Lee, H. H. (1995). Nucleic acid amplification methods. Journal 

of Microbiological Methods, 23, 3–20. 

9. Wittwer C. Rapid Cycle Real-Time PCR: Methods and Aplications. Rapid Cycle 

Real-Time PCR: Methods and Aplications. Meuer S, Wittwer C, Nakagawara KI 

(Eds.) Page:1-8. 

10. Taylor TB, Patterson C, Hale Y, Safranek WW. (1997). Routine Use of PCR- 

Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis for Identification of 

Mycobacteria Growing in Liquid Media. J Clin Microbiol. 35:79-85. 

11. Pao CC, Yen B, You JB, et. al. (1990). Detection and identification of 

Mycobacterium tuberculosis by DNA amplification. Journal Clinical Microbiology, 

28: 1877-1880. 

12. Almeda J, Garcia A, Gonzales J, et. al. (2000). Clinical evaluation of an ›nhause 

IS6110 polymerase chain reaction for diagnosis of tuberculosis. Eur. J. 

Clin. Microbiol. Infect. Dis. 19: 859-867. 

13. Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R. (1991). Chelex-100 as a medium for simple 

extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques, 

10: 505-513. 

14. Torres M, Criado A, Polomares J, et. al. (2000). Use of real-time PCR and 

fluorimetry for rapid detection of rifampin and ›soniazid resistance-associated 

86

mutations in M. tuberculosis . Journal of Clinical Microbiology, 38(9): 3194-3199. 

15. Henegariu O, Heereme NA, Dlougy SR et. al. (1997). Multiplex PCR: critical 

parameters and step by step protocol. Bio Techniques, 23: 504-511. 

16. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et. al. (1988). Primer-directed enzymatic 

amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239:487- 

491. 

17. Pershing DH. (1991). Polymerase chain reaction: trenches to benches. Journal 

Clinical Microbiology, 29: 1281-1285. 

EK: 

1. Baz› mycobacterium türlerinin DNA amplifikasyon ürünlerinin BstEII ve HaeIII 

enzimleri ile kesim sonucu oluflan DNA bant paternleri (fiekil 1) 

2. PCR-RFLP ile mikobakterilerin identifikasyon tablosu (fiekil 2) 

fiekil 1 : Is› flok proteinini kodlayan gen bölgesinin ampifikasyon ürününün BstEII 

enzimi ile kesilmesi sonucu elde edilen bant patern görüntüleri 

fiekil 2: Is› flok proteinini kodlayan gen bölgesinin ampifikasyon ürününün HaeIII 

enzimi ile kesilmesi sonucu elde edilen bant patern görüntüleri 

87

TÜBERKÜLOZUN MOLEKÜLER TANISINDA T‹CAR‹ S‹STEMLER 

“‹zotermal Dizi Yer De¤ifltirme Amplifikasyonu Tekni¤inin Kullan›m›” 

Strand Displacement Amplification (SDA) 

Doç.Dr.Mustafa ÖZYURT 

GATA Haydarpafla E¤itim Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Servisi, 

‹stanbul 

Tüberküloz (TB), dünyada önemi hergün artmakta olan ve halk sa¤l›¤›n› 

tehdit edebilen major tehlikelerden biri olup en s›k ölüme neden olan infeksiyon 

hastal›klar›ndan biridir. TB olgular›n›n %95’ten fazlas› geliflmekte olan ülkelerde 

görülmekte olup dünya nüfusunun yaklafl›k üçte birinden fazlas› M.tuberculosis 

ile enfektedir. TB hastalar›n›n erken tan› ve tedavisi bu hastal›ktan toplumun 

korunmas›nda en etkili yoldur. Bu nedenle ulusal TB kontrol programlar› 

çerçevesinde mikobakteriyoloji laboratuvarlar›n›n birincil amac›n›, insidans› 

düflürmek için enfeksiyöz akci¤er tüberküloz olgular›n›n en k›sa sürede tespiti, 

do¤ru identifikasyonu ve tedavisinin takibi oluflturur. Bu nedenle klinik 

mikobakteriyoloji laboratuvarlar›, tüberkülozun yay›l›m›n› önlemede ve kontrol 

alt›na alabilmede önemli bir role sahiptir. 

Tüberkülozda ilk tan› klinik verilerle yap›lm›fl olsa bile kesin tan› için 

etken mikroorganizman›n konvansiyonel olarak direkt bak›da tespiti ve 

laboratuvarda üretilerek tan›mlanmas› esast›r. Bu nedenle tan›da “gold standart” 

kültür ve klinik tan› birlikteli¤idir. Laboratuvar tan› için her iki yöntemin de 

önemli eksiklikleri vard›r. Mikroskobik incelemede aside dirençli basilin 

görülebilmesi için örne¤in mililitresinde 5.000-10.000 kadar bakteri bulunmas› 

gerekmektedir. Kültür ile örnekteki birkaç canl› bakterinin dahi gösterilebilmesi 

mümkündür ancak mikobakteriler, yavafl üreyen mikroorganizmalar olduklar›ndan 

bu testlerin tamamlanmas› için ortalama 2-8 haftaya gereksinim duyulur. Son 

y›llarda TB ilaçlar›na dirençli basillerin izolasyonlar›ndaki art›fl ve tan›ya yönelik 

konvansiyonel testlerin pratik olmamalar›, uzun zaman gerektirmeleri ve tür 

düzeyinde tiplendirmede yetersiz kalmalar› rutin kullan›mda sorunlar›n çözümüne 

yönelik aray›fllar› yeniden gündeme getirmifltir. 

Bu amaçla son 15-20 y›l içinde mikobakterilerin hastal›k örneklerinden ve kat›- 

s›v› kültür ortamlar›ndan saptanmas›, tür düzeyinde tan›mlanmas› ve duyarl›l›k 

testleri için, özgüllük ve duyarl›l›¤› yüksek, güvenilir, h›zl› sonuç verebilen ve 

kolay uygulanabilir yöntemler üzerinde çal›flmalar h›z kazanm›flt›r. Bunlardan, 

Radyometrik (BACTEC) ve kromotografik (HPLC) sistemler , nukleik aside dayal› 

moleküler yöntemler, mikobakteriyofajlarla RIF direnç tayini (Faj amplifikasyonu) 

90

gibi fenotipik ve genotipik teknikler tan› süresini k›saltmada ve tedaviye yönelik 

antibiyotik direnci ile ilgili mutasyonlar›n saptanmas›nda umut verici yöntemlerdir. 

Bu amaçla günümüzde, hasta örneklerinden direkt olarak MTBC varl›¤›n› 

araflt›rmak amac›yla nükleik asit amplifikasyon (NAA) esasl› sistemler ile kültürde 

üreyen mikobakterilerin k›sa sürede tür düzeyinde tan›mlanmas›n› ve/veya TB 

ilaçlar›na karfl› direnç ile iliflkili mutasyonlar› saptamada, Klasik PCR ve RFLP’nin 

yan›s›ra DNA prob hibridizasyonu easl› ürünler, DNA sequence analiz kitleri ve 

moleküler biyoloji ile bilgisayar teknolojisini birlefltiren DNA microarray teknolojisi 

ürünler tan›ya h›z kazand›rm›flt›r. 

Özellikle Smear pozitif solunum örneklerinde kullan›m›na FDA taraf›ndan 

onay verilen nükleik asit amplifikasyon temeline dayanan ticari moleküler 

sistemlerden (Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD,Gen-Probe) 

ve Cobas AMPLICOR MTB Assay (Roche Diagnostic System) ) ile FDA onay› 

olmamakla birlikte di¤er kurulufllardan onay alm›fl ve sat›fla sunulmufl olan BD 

ProbeTec TM ET Mycobacterium tuberculosis complex DIRECT TB (DTB, BD 

Biosciences)’ e ait çal›flma sonuçlar› klinik de¤erlendirmelerde yüksek sensitivite 

ve spesifite gösterebilmektedir. 

CDC (Center for Disease Control and Prevention)’nin önerileri 

do¤rultusunda tüberkülozun laboratuvar tan›s›na yönelik h›zl› testler aras›nda 

yer alan DNA amplifikasyon teknikleri günümüzde rutin tan›da önemli bir yere 

sahiptir. Bu tekniklerden biri de Dizi Yer De¤ifltirme Amplifikasyonu “Strand 

displacement amplification, SDA ’d›r. 

Bu kursta, SDA teknolojisi prensibi ile çal›flan ve 3.jenerasyon bir ticari 

sistem olan BD ProbeTec TM ET‘nin do¤rudan solunum örneklerinde Mycobacterium 

tuberculosis complex’in saptanmas› amac› ile üretilmifl Direct TB saptama kitinin 

(DTB) uygulamal› e¤itimi verilecek BDProbe Tec ET sistemi ve SDA tekni¤i 

tan›t›lacakt›r. 

BDProbe Tec ET sistemi, nükleik asit amplifikasyonu (NAA) esas›na dayal› 

bir yöntem olan SDA prensibi ile çal›flan ve floresan enerji transfer saptama 

teknolojisiyle birlefltirilmifl, direkt olarak hastaya ait solunum örneklerinde 

(balgam, indüklenmifl balgam, BAL ve di¤er solunum örnekleri) ve/veya pozitif 

kültürlerde M.tuberculosis complex’e ait genetik materyali izotermal olarak 

hedef ço¤alt›p saptayabilen, kullan›m kolayl›¤› olan yar› otomatize bir sistemdir. 

Hedef DNA, özgül primerler, DNA polimeraz, restriksiyon enzimi ve 

floresan iflaretli saptama probu SDA tekni¤inin ana bileflenlerini oluflturur. Bu 

sistem için primer amplifikasyon hedefleri IS 6110 insersiyon dizisi ve 16S rRNA 

genidir. Söz konusu sistem, örneklerdeki hedef DNA’n›n amplifikasyonu ve 

saptanmas›n› kapal› bir sistem format›nda, SDA için gerekli reaktiflerle kaplanm›fl 

91

kopar›labilir stripler halindeki kuyucuklarda gerçekleflirirken ayn› zamanda 

kontaminasyona karfl› k›smen güvenli bir ortam sa¤lar. Sistemde, inhibitör varl›¤›n› 

saptamak amac›yla internal amplifikasyon kontrolü (IAC) kullan›l›r. Böylece 

yalanc› negatiflikler önlenebilmekte ayr›ca kalite kontrol amaçl› pozitif ve negatif 

kontroller kullan›larak test sonuçlar›n›n güvenilirli¤i artt›r›labilmektedir. Bu testin 

duyarl›l›k ve özgüllü¤ü smear pozitif solunum örneklerinde oldukça iyidir. Testin 

tedavi görmekte olan hastalarda kullan›m› önerilmemekle birlikte tedaviye yeni 

bafllanm›fl (1haftadan daha k›sa süreli) hastalarda takip amaçl› kullan›labilmektedir. 

Hasta örne¤inden M.tuberculosis complex’in BDProbeTec ET sistemi ile saptanma 

süresi total olarak yaklafl›k 3.5 saat’tir 

BD ProbeTec TM ETMycobacterium tuberculosis complex DIRECT TB (DTB) 

TEST‹N ÇALIfiMA PRENS‹B‹ 

BD ProbeTec TM ET, Mycobacterium tuberculosis complex (DTB) Direct 

Detection Testi, amplifikasyon primerleri ve floresan iflaretli dedektör problar 

kullan›larak flüpheli hastalara ait özellikle NALC-NaOH ile dekontamine edilmifl 

solunum örneklerinde bulunan M.tuberculosis complex’e (M.tuberculosis, M.bovis, 

M.bovis BCG, M.africanum ve M.microti) ait hedef DNA ( IS6110 insersiyon 

dizisi)’n›n aranmas› ve efl zamanl› amplifikasyonu esas›na dayan›r. 

Bu amaçla, kurutulmufl, oda ›s›s›nda saklanabilen, SDA için gerekli 

reaktiflerle kapl›, kopar›labilir stripler halindeki disposable priming ve amplifikasyon 

kuyucuklar› kullan›l›r. Test s›ras›nda çal›flmaya ayr›ca bir reaktif eklemeye gerek 

duyulmaz. Haz›rlanm›fl hasta örne¤i, ilk önce içerisinde primerler, floresan iflaretli 

detektör prob ve amplifikasyon için gerekli di¤er reaktifleri içeren priming 

kuyucuklar›na inokule edilir. ‹nkübasyonu takiben kuyucuklardaki reaksiyon 

kar›fl›m›, içerisinde SDA için gerekli bir DNA polimeraz (Bst DNA polimeraz) ile 

bir restriksiyon enzimi ( BsoB-I) ve dNTP’ler ile kapl› amplifikasyon kuyucuklar›na 

aktar›l›r. Amplifikasyon kuyucuklar›n›n üzeri kontaminasyonu önlemek amac›yla 

kapat›l›r ve cihaza yerlefltirilerek inkübasyona b›rak›larak test edilir. Sistemde, 

reaksiyonlar örnek ve kontroller birarada efl zamanl› olarak gerçekleflir. DNA 

polimeraz , tek sarmall› zincir üzerinde 5’ – 3’ yönünde uzamay› bafllat›r, ço¤alt›lan 

çift sarmal› DNA üzerinde 4-8 baz çiftlik spesifik hedef bölge restriksiyon enzimi 

ile tan›narak kesilir. Kesme ifllemi sonras› parallel döngüye gönderilen hedef 

DNA, ortamda bulunan saç tokas› yap›s› gösteren floresan iflaretli detector 

problarla hybridize olarak, sistem taraf›ndan Floresan Enerji Transferinin eflzamanl› 

amplifikasyonu sonucu saptan›r. 

Bu reaksiyonu detayl› olarak aç›klarsak; Öncelikle hasta örne¤inde 

aran›lan hedef DNA, ›s› veya kimyasallarla denature edilerek heliks yap›daki iki 

92

zincir birbirinden ayr›l›r ve tek zincirli yap›ya dönüfltürülür. DNA zinciri üzerinde 

yer alan ve sadece aran›lan patojene spesifik bir alan, SDA ‘ için hedef bölge 

olarak kullan›l›r. Yöntemde kullan›lan primerler ise hibrit çifti oluflturmak üzere 

bu hedefe ba¤lanan komplementer DNA problar›d›r. SDA için di¤er bileflenlerden 

olan DNA polimeraz ortamdaki serbest nükleotidlerin (dNTP) bir flablon halinde 

DNA zincirine ba¤lanarak zincirin 5’ ucundan 3’ ucuna do¤ru uzamas›n› ve kal›p 

(tamplete) DNA oluflumunu katalize eder. SDA’da iki primer (S1 ve B1) zincire 

5’ ucundan ba¤lan›r. Polimeraz etkisi ile ortamdaki serbest nukleotidler kullan›larak 

5’-3’ istikametinde uzama gerçekleflir ve komplementer tarzda DNA zinciri 

oluflmaya bafllar. S1 ve B1 in her ikiside B1 yönünde uzarken S1 zinciri, orjinal 

5’-3’ hedefin komplementeri tek zincire dönüflür. Uzama bir ucda sonlan›r ve 

içerisine dCTPS ( deoksisitidin 5’- tiotrifosfat sitozin) dahil olur. Bu zincir ona 

ba¤lanan S2 ve B2 primerlerine komplementer olan sekanslar› içerir. Bu zincire 

ba¤lanan S2 ve B2 primerleri uzayarak S1 ve S2 orjinal primerleri ile s›n›rland›r›lm›fl 

bir hedef bölgesi içeren tek zincir oluflturur. Art›k S1 komplementeri ve orjinal 

hedef dCTPS içerir. Buna S1 primeri ba¤lan›r ve çift sarmall› DNA oluflturmak 

üzere uzar. Restriksiyon enzimi ( BsoB-I, restriction endonuclease) S1orjinal 

primeri spesifik sekans›ndan keser. Ancak S1 komplementeri dCTPS içerdi¤inden 

S1 komplementer kopyas›n› kesemez. Bu kesilmifl k›s›m polimeraz›n etkisiyle 

uzad›kça geride kalan S1 primeri itilmek suretiyle hedef kopya paralel döngüye 

gönderilir. Bu döngü test süresince süreklilik arzeder ve ortamda milyonlarca 

kopya oluflur.(fiekil 1-6) Oluflan bu hedef DNA’lar, ortamda bulunan ve “saç 

tokas›” yap›s› gösteren floresan iflaretli detector problarla eflzamanl› hybridize 

olur. Bu reaksiyonda her iki floresan molekül birbirlerine yak›n iken floreseine 

gönderilen enerji, floreseinden Rodamini active etmek için transfer edilir. Sonuçta 

system otomatik olarak pleytteki kuyucuklardan gelen floresan sinyalleri 60 

dakikal›k test süresince otomatik okuyucuda dakikada bir kez okuyarak RFU 

(rölatif floresan ünitesi) olarak saptay›p hesaplama yapar (fiekil 7-10) . Bu 

de¤erlendirme için MOTA (Method other than acceleration) skoru belirlenir. Bu 

skor, reaksiyon sonras›nda oluflan sinyalin de¤erlendirilmesi ve ölçülmesinde 

kullan›l›r. Ortamda aran›lan hedefin var olup olmad›¤›, hesaplanan MOTA de¤eri 

ile hasta örne¤i veya kontrol için daha önceden belirlenen “cut-off MOTA” 

de¤erlerinin karfl›laflt›r›lmas› ile kalitatif olarak saptan›r. 

93

fiekil 1 fiekil 2 





94

BD ProbeTEC ET Genel Özellikler 

1. SDA (Dizi yer de¤ifltirme reaksiyonu) tekni¤i ile çal›fl›r. 

2. Amplifikasyon, Izotermal (tek ›s›da ço¤altma) olarak gerçekleflir. 

3. Amplifikasyon ve floresan saptama efl zamanl› olarak 1 saatte gerçekleflir 

4. SDA için gerekli bütün primer, prob, enzim gibi reaktifler kopar›labilir striplere 

ait kuyucuklara kapl›d›r, 

5. Test s›ras›nda ayr›ca reaktif eklemeye gerek yoktur. Kitler 96 kuyucukludur. 

6. Amplifikasyon aflamas›nda kuyucuklar›n üzeri bir bant ile kapat›larak 

kontaminasyon engellenir 

7. Tek odada çal›flma kolayl›¤› sa¤lar 

8. Güvenilirdir, internal amplifikasyon kontrolü (IAC) kitin içinde mevcuttur 

9. Kitler oda ›s›s›nda saklanabilir 

10. Yar› otomatize bir system olup cihaz bak›m› ve test prosedürü kolayd›r 

11. Kinetik okuma ile sonuçlar›n yorumu kolayd›r. 

12. DTB kit prosedürü, balgam bronco alveolar lavaj, brofliyal ve trakeal aspirate 

gibi solunum örnekleri için test edilmifltir. Di¤er numuneler için performans› 

de¤erlendirilmemiflitir. 

13. DTB testi M.tuberculosis complex’i di¤er M. tuberculosis, M.bovis, M.bovis 

BCG, M.africanum, ve M.micoti’den ay›ramaz. 

14. M. tuberculosis complex probe sekans› , IS6110 M. tuberculosis, M.bovis, 

M.bovis BCG, M.africanum, ve M.micoti için spesifiktir. 

15. Testin optimal performans› için uygun numune al›m› ve transportu 

gerekmektedir. 

16. DTB Testi M.tuberculosis complex varyantlar›n› IS6110 insersiyon sekans 

eksikli¤i oldu¤undan saptamaz. 

17. DTB testi kalitatif sonuçlar verir. MOTA de¤erleri ile pozitif numunedeki 

hücre say›s› aras›nda korelasyon yoktur. 

D‹KKAT ED‹LMES‹ GEREKL‹ HUSUSLAR 

1. Test performans› , solunum örnekleri d›fl›ndaki di¤er numunelerden (Kan, 

BOS, gaita, ve idrar için) M. tuberculosis complex’›n saptanmas›na yönelik 

de¤erlendirme yap›lmam›flt›r. 

2. Priming kuyucuklar›nda insan Plasental DNA’s› kullan›ld›¤›ndan reaktifler 

infeksiyöz olarak de¤erlendirilmelidir. 

95

3. Is› inaktivasyonu ifllemine kadar numune ifllemleri Class II Biyolojik Emniyet 

Kabininde yürütülmeli, bu peryoda kadar olan santrifüj ifllemleri aresol 

koruyuculu rotor kullan›larak yap›lmal›d›r. Aerosol koruyuculu rotor güvenlik 

kabininde aç›lmal›d›r.Standart rotor ›s› ile inaktivasyon iflleminden sonra 


4. Örnekler CDC önerileri dikkate al›narak NALC-NaOH metodu ile dekontamine 

edilmeli veya alternative olarak ayn› içerikli haz›r dekontaminasyon kitleri (Ör: 

BBL Mycopreb kiti) kullan›lmal›d›r. 

5. Örnekler hemen çal›fl›lmayacaksa NACL/NaOH sedimentleri 2-8 C’ta 5 güne 

kadar bekletilebilir. 5 günden daha uzun sure çal›fl›lmayacaksa 3 ay’a kadar -20 

C veya daha so¤ukta dondurularak bekletilebilir. Dondurulmufl örnekler, 

çal›flmadan once oda ›s›s›na getirilerek çözülmelidir. 

6. Tüm numuneler, MOTT yönünden de araflt›r›lmal› ve Antibiyotik 

duyarl›l›klar›n›n araflt›r›lmas› amac›yla kültürleri yap›lmal›d›r. 

7. Numunelerde HIV veya Hepatit B gibi patojenik infeksiyonlar mevcut 

olabilece¤iden numuneler enfeksiyöz olarak kabul edilerek gerekli laboratuvar 

prosedürleri , uluslaras› öneriler takip edilmelidir. 

8. DTB Wash Buffer 1 ve DTB Nötralizasyon Buffer 3 dimetilsulfoksid içerir. 

Dimetil sulfoksid solundu¤unda veya cilt ile temasta yüksek toksiktir. Göze 

s›çramas› halinde bol su ile y›kama yap›lmal›d›r. Kontamine k›yafetleri hemen 

üzerinizden ç›kart›n ve cildinizi su ve sabunla y›kay›n. 

9. DTB Wash Buffer1 ve DTB Lysis Buffer yüksek alkalidir. Cilt ,göz ve mukoz 

membran ile kontak edilemesinden sak›n›lmal›. Kontak edilmesi durumunda 

derhal bol su ile y›kama yap›lmal›d›r . Y›kama yap›lmad›¤› durumlarda yan›klar 

oluflabilir. 

10. Pipet uçlar›n›, numune tüplerini, Priming kapaklar›n› atarken uygun 

laboratuvar prosedürlerini uygulay›n. 

11. Özel santrifüjleme önerileri uygulanmal›d›r, uygunsuz santrifüjleme yalanc› 

negatifli¤e sebep olabilir. 

12. DTB testi antibiyotik tedavisi için kültür yönteminin yerini tutamaz. 

13. Pirimer ve Amplifikasyon Mikrokuyucuk pofletleri kullan›mdan sonra 

dikkatlice yap›flt›r›lmal›d›r. ‹çerisinde nem tutucu pedlerin oldu¤undan emin 

olunmal›d›r 

96

BD ProbeTEC ET M. tuberculosis Complex DIREKT TB ÇALISMA PROSEDÜRÜ 

fiekil 11 

I-ÖRNEK HAZIRLAMA PROSEDÜRÜ (fiekil12) 

A.ÖRNEK HAZIRLAMA (B‹YOEMN‹YET KAB‹N‹ DIfiI ‹fiLEMLER) 

a) Tüm buffer’lar oda ›s›s›nda tutulmal› ve kullan›m öncesi iyice kar›flt›r›lmal›d›r. 

Stok buffer solusyonlar›ndan örnekler afla¤›daki gibi haz›rlan›r; 

• DTB Wash Buffer-1: Her NALC-NaOH sedimenti için kaba 1 ml aktar›l›r. Ayr›ca 

pipetleme hatas› göz önüne al›narak 1-2 ml ekstra ilave edilir. 

• DTB Lysis Buffer-2: Her NALC-NaOH sediment ve kontroller için kaba 0.1 ml 

aktar›l›r. Ayr›ca pipetleme hatas› göz önüne al›narak 0.5-1 ml ekstra ilave 

edilir. 

• DTB Nötralizasyon Buffer-3: Her NALC-NaOH sediment ve kontroller için 

kaba 0.6 ml aktar›l›r. Ayr›ca pipetleme hatas› göz önüne al›narak 0.5-1.0 ml 

ekstra ilave edilir. 

b) Daha sonra artan bufferlar stok solusyonlar›n içerisine konmaz at›l›r . 

c) Çal›fl›lacak her hastaya ait NALC-NaOH sediment için 2 ml’lik örnek tüpleri 

haz›rlan›r ve üzerleri örnek numaras› ile etiketlenir. 

d) Tüplerin kapaklar› aç›larak her tüpe 1ml DTB Wash Buffer-1eklenir ve tüplerin 

kapa¤› kapat›l›r. 

e) Hasta örneklerine ait DTB Wash Buffer-1 ilave edilmifl tüpler biyoemniyet 

kabinine (BSC) b›rak›l›r. 

97

B. ‹fiLENM‹fi HASTA NUMUNELER‹NDEN YAPILAN ‹fiLEMLER 

(B‹YOEMN‹YET KAB‹N ‹Ç‹ ‹fiLEMLER) 

Kontamine örnekleri dökmek için kabin içinde infekte s›v› at›k kab› 

bulundurulur. 

a) Falkon tüplerindeki NALC-NaOH sedimentleri 5 sn vortexlenir 

b) Filtreli pipet ucu kullanarak sedimentlerden 500 μL al›n›p içerisinde 1 ml DTB 

Wash Buffer-1 içeren tüpe eklenerek tüpün kapa¤› kapat›l›r. 

c) Buraya kadarki ifllemler her hasta numunesi için uygulan›r. 

d) ELD‹VEN DE⁄‹fiT‹R‹L‹R 

e) Her tüp 5sn. Vortexlenir 

f) Tüpleri aerosol koruyuculu rotora yerlefltirilip rotor kapa¤› iyice kapat›larak 

mikrosantrifujede 12,200 X g ‘de 3 dk. çevrilir . Uygun flekilde santrifüj edilmemesi 

yanl›fl negatifli¤e sebep olabilir. 

g) Santrifüj sonras› süpernatan kabin içerisinde s›v› at›k kab›na dökülür. 

h) Tüpler, kapaklar› kapat›larak numune rak›na yerlefltirilir. 

i) ELD‹VEN DE⁄‹fiT‹R‹L‹R 

C. ÖRNEKLERE ISI UYGULAMA 

a) Tüplerin kapaklar›n›n s›k›ca kapal› oldu¤u kontrol edilir. 

b) Numune rak›ndaki numuneler f›r›na yerlefltirilir, kapa¤› kapat›l›r 

c) RUN #01 seçilir ve OK’e bas›l›r 

d) Uygulamay› bafllatmak için “Start” tufluna bas›l›r, 30 dk. süreyle ›s› uygulamas› 

gerçeklefltirilir. 

e) Is›tma bafllad›ktan sonra afla¤›daki basamaklar takip edilir 

• Sonikatör haz›rlan›r ( Sonikatör musluk suyu ile su seviyesi dikkate al›narak 

doldurulur, içerisine banyo rak› yerlefltirilir, Is›t›c› 65ºC’ye ayarlan›r ve ›s›tma 

ifllemi bafllat›l›r. Cihaz kapa¤› kapal› halde iken 60 dk Degas ifllemi yap›l›r.) 

• Santrifüje standart motoru yerlefltirilir 

f) 15 dk’l›k ›s›tmadan sonra, ›s›n›n 95ºC’e ulafl›p ulaflmad›¤›n› kontrol et. 

g) F›r›ndaki ›s›tma bitti¤inde sesli kap›y› açarak numune rak›n› çkart›l›r. 

Not: Numune tüplerindeki muhtemel mikobakterilerin art›k öldü¤ü varsay›l›r. 

Bu aflamadan sonraki ifllemlere kabin d›fl›nda devam edilebilir. Ancak numunelere 

yinede bioyolojik tehlikeli madde olarak muamele edilmelidir. 

98

D. ÖRNEK DNA’ NIN AÇI⁄A ÇIKARILMASI (Lysis) 

a) Is›tma ifllemi tamamlanan numune tüpler mikrosantrifüje konur. 

b) Santrifijün kapa¤› kapat›l›r ve k›sa süreli (10 sn. ) çevrilir. 

c) Santrifüj sonras› tüplerdeki yo¤unluk kontrol edilir ve gerekirse ifllem 

tekrarlan›r. 

d) Tüpler numune rak›na yerlefltirilir. 

e) Filtreli pipet ucu ile her bir tüpe 100 μL DTB Lysis Buffer 2 eklenir. 

f) Her bir numune için ayr› bir pipet ucu kullan›lmal›d›r. 

g) ELD‹VEN DE⁄‹fiT‹R‹L‹R. 

h) Tüm tüpler 5 sn. vortexlenir ve tüpler numune rak›na iyice yerlefltirilir. Bununla 

maksimum düzeyde ultrasonik enerjiye maruziyet sa¤lan›r. 

i) Ultrasonik banyoda su seviyesi ve ›s›n›n 65 (+/- 5)°C olup olmad›¤› dijital 

termometre ile kontrol edilir. 

j) Tüpler numune rak›ndan Sonik Banyo Rak›na yerlefltirilir ve kapa¤› kapat›l›r. 

k) 45 dk. Süreyle sonikasyon gerçeklefltirilir. 

l) Sonikasyon sonunda numune rak› kurutma amac›yla havlu ka¤›d üstüne 

konur . 

E. NÖTRAL‹ZASYON 

a) Sonike edilmifl numune tüpleri standart rotor yerlefltirilmifl mikrosantrifüje 

konur. 

b) Santrifijün kapa¤›n› kapat›l›r ve k›sa süreli (10 sn. ) çevrilir. 

c) Santrifüj sonras› yo¤unluk kontrol edilir gerekirse santrifüj ifllemi tekrarlan›r. 

d) Tüpler temiz pipetleme rak›na yerlefltirilir. 

e) Filtreli pipet ucu ile her bir tüpe 600 μL DTB Nötralizasyon Buffer 3 eklenir. 

f) Her bir numune için ayr› bir pipet ucu kullan›lmal›d›r. 

g) ELD‹VEN DE⁄‹fiT‹R‹L‹R 

h) Her tüp 5 sn. Vortexlenir 

i) Tüpler, tekrar temiz pipetleme rak›na yerlefltirilir. 

99

Numuneler art›k BDProbeTec ET Sisteminde amplifikasyon için haz›rd›r. Ancak 

bu aflamada numuneler opsiyonel olarak bekletilebilir. Bu amaçla; 

• 18-33ºC’de 12 saate kadar. 

• 2 – 8ºC’de 4 güne kadar saklanabilir. Çal›flmadan önce numuneler için ›s›tma 

aflamas› tekrarlanmal›d›r. 

• -20ºC veya daha düflük ›s›larda 3 aya kadar dondurulmufl olarak saklanabilir. 

• Bu numunelere çal›flma öncesi oda ›s›s›nda çözdürülerek ve ›s›tma aflamas› 

tekrarlanmal› ve 10 sn kadar santrifüj edilerek yo¤unlu¤u kontrol edilmelidir. 

100

II. TEST PROSEDÜRÜ 

A. TEST C‹HAZLARINI HAZIRLAMA 

Test ifllemi öncesi sistemle ilgili tüm cihazlar›n çal›flma ›s›s›lar› ayarlanarak durumlar› 

stabil hale getirilir. 

• Priming heater 72.5ºC ve Warming Heater 54ºC olmal› 

• BDProbeTec ET cihaz› ekran›nda ›s› 47.5-55.0 ºC okunmal›d›r 

B. BDProbeTec ET Pipettor PROGRAMLAMA 

• Program 1 Çal›flma örneklerinden 200 μL ul çekilir –Priming kuyucuklar›na 

150 μL ul da¤›t›l›r. 

• Program 5 Priming kuyucuklar›ndan 100 μL çekilir – Amplifikasyon kuyucuklar›na 

100 μL da¤›t›l›r, 50μL ile 3 kez kar›flt›r›l›r 

C. BDProbeTec ET C‹HAZINA ÖRNEK YÜKLEME DÜZEN‹N‹ PLANLAMA 

Hasta örneklerine ait bilgi girifli, kit ve kontrol lot numaralar› sisteme girilir. 

Priming ve Amplifikasyon kuyucuklar›n›n ay›r›m› ve örnekleme için kopar›labilir 

striplerin yerleflimi ayr› ayr› düzenlenir. 

D. ÇALIfiMA KONTROLLER‹N‹N HAZIRLANMASI 

• DTB Lysis Buffer 2 ve DTB Nötralization Buffer 3 kullan›m öncesi oda 

›s›s›nda bekletilir ve iyice kar›flt›r›l›r. 

• Her çal›flmaya bir DTB Negatif ve bir DTB Pozitif Kontrol tüpü ilave 

edilir. Bu tüplerin her birine yeni bir pipet ucu ile 100 μL DTB Lysis Buffer 2 

ve 600 μL DTB Nötralizasyon Buffer 3 eklenir. 

• Tüpler 5sn vortexlenir . 

• Vortekslemeyi takiben mikrosantrifüjde 10 sn santrifüj edilir ve tüpler 

temiz pipetleme rak›na yerlefltirilir. 

E. TEST PROSEDÜRÜ (fiekil : 13-19) 

a) Kontrol ve numune tüp kapaklar› aç›l›r. 

101

) ELD‹VEN DE⁄‹fiT‹R‹L‹R 

c) Plate yerleflim plan›na göre Priming kuyucuklar› haz›rlan›r, 

d) Pipet program› seçilir (DTB Pipet Prog 1), pipetörün uç aral›klar› ayarlan›r 

e) Numune ve kontrol tüplerinden 200 μl çekilir. 

f) Pipet aral›¤› kapat›l›r ve Priming kuyucuklar›na 150 μL numune aktar›l›r 

(Aktarma yap›l›rken kuyucuklar›n duvar›na do¤ru b›rakmak kross 

kontaminasyonun önlenmesi için önemlidir). 

g) Pipet uçlar› at›l›r ve numune tüpleri yeni kapaklarla kapat›larak kald›r›l›r. 

h) Priming kuyucuklar›n›n üzeri plastik kapa¤› ile kapat›larak 20 dk oda ›s›s›nda 

inkübasyona b›rak›l›r ( Bu süre 6 saate kadar uzat›labilir) 

i) ELD‹VEN DE⁄‹fiT‹R‹L‹R 


a) ‹nkübasyon süresinin sonuna do¤ru Priming kuyucuklar›n›n haz›rlan›fl›na 

benzer flekilde Amplifikasyon kuyucuklar› haz›rlan›r 

b) Süre sonunda Priming kuyucuklar› üzerindeki plastik kapak ç›kart›l›r ve Priming 

Is›t›c›s›na (72C) konulur. Buna paralel olarak ayn› zaman dilimi içerisinde haz›rlanan 

Amplification kuyucuklar›da Amplifikasyon ›s›t›c›s›na yerlefltirilir 

(54 C). 10 dk. (+ / - 1 dk.) beklenir. Bu aflamada süre oldukça kritiktir. 

c) ‹nkübasyon s›ras›nda Pipetörde ‘’DTB Pipet Prog 5’’ seçilir. Süre bitiminde 

Priming kuyucuklar›ndan 100 μL al›n›p Amplifikasyon kuyucuklar›na aktar›l›r 

ve hava kabarc›¤› oluflturmadan pipet program›n›n 50 μL ‘lik hacmi ile üç kez 

kar›flt›r›l›r. 

d) ‹fllem tamamland›¤›nda Amplifikasyon kuyucuklar›n›n›n üzeri yap›flkan bir 

kart ile tüm test kuyucuklar› tamamen kapat›l›r. Yap›flkanl› kapak pla¤›n d›fl›na 

ç›kmamal›d›r (aksi takdirde cihazdaki okumalarda hata ç›kabilir) 

102


a) Amplifikasyon kuyucuklar›n› tafl›yan plak 30 sn içinde BDProbeTec ET cihaz›na 

yerlefltirilir ve cihaz çal›flt›r›l›r. (fiekil 17) 

b) Çal›flma tamamland›¤›nda rapor otomatik olarak cihaz›n yaz›c›s›ndan al›n›r 

(fiekil 18) 

c) Cihazdan ifllemi tamamlanm›fl plak d›flar› ç›kart›l›r. Kuyucuklar›n yap›flt›r›c›s› 

aç›lmadan metal plaktan ç›kart›larak at›k pofletine konur. Pofletin a¤z› kapat›larak 

at›k kab›na b›rak›l›r. 

d) Metal Plak %1 sodyum hipoklorit ile temizlenir distille veya deiyonize su ile 

silinir ve temiz bir ka¤›t havlu ile kurutulur. 

fiekil :17 

BDProbeTec ET amplifikasyon ve 

detection cihaz› 

fiekil 18: 

Çal›flma Raporu ve Yorumu 

103

F. DE⁄ERLEND‹RME 

Cihaz›n verdi¤i MOTA (Method Other Than Acceleration) skoru; Reaksiyon 

sonunda oluflan sinyalin de¤erlendirilmesinde ve ölçülmesinde kullan›l›r (Tablo 

1). Bu de¤erler; 

• ‹lk dakikadaki background okumas›ndan ç›kart›larak elde edilir. 

• Bu de¤er e¤imin alt›nda kalan alan› tan›mlar 

• Test tamamen kalitatifdir; amplifikasyon numuneden numuneye de¤ifliklik 

göstersede, MOTA de¤eri ile numundeki hedef miktar› aras›nda bir ba¤lant› 

yoktur. 

104

Tablo : 1 Beklenen Cut-off MOTA de¤erleri 

Örne¤in MOTA De¤eri IAC MOTA De¤eri Aç›klama 

> 3.400 Bak›lmaks›z›n Pozitif 

5.000 Negatif 

y a commercial polymerase chain reaction kit. Pathol Biol (Paris) 1998 Oct ; 46 

(8):597-603 

4. Bergmann J.S, Keating W.E, Woods G.L.: Clinical evaluation of the BD ProbeTec 

ET system for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 

(2000) Feb; 38(2):863-65 

5. Bogard M, Vincelete J, Antinozzi R, et all. : Multicenter study of Commercial, 

Automated Polymerase Chain Reaction System for the Rapid Detection of 

Mycobacterium tuberculosis in Respiratory Specimens in Routine Clinical Practice. 

Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2001) 20 : 724-731 

6. Gerdes R.: Evaluation of BD Probe Tec ET System for Direct Detection of 

Mycobacterium tuberculosis from Clinical respiratory specimens using Strand 

Displacement Amplification technology. Abstr.U-68 , ESM 2000 

7. Johansen I.S, Thomsen V, Johansen A, Andersen P, Lundgren B.: Evaluation 

of a New Commercial Assay for Diagnosis of Pulmonary and Nonpulmonary 

Tuberculosis . Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2002) 21 : 455-460 

8. Kocagöz T.: Tübeküloz tan›s›nda yenilikler. H.Eraksoy, O.fi.Yenen 

(Edt.),‹nfeksiyon hastal›klar› ve Klinik mikrobiyoloji 2000, Klinik Mikrobiyoloji ve 

‹nfeksiyon Hastal›klar› Derne¤i Yay›nlar›. No.19 , sayfa :25-33, 2000 

9. Piersimoni C, Scarparo C, Piccoli P, Rigon A, Rugiero G, Nista D, Bornigia S.: 

Performans assesment of two commercial amplification assays for Direct Detection 

for Mycobacterium tuberculosis Complex from respiratory and extrapulmonary 

specimens. J Clin Microbiol (2002) Nov; 40(11):4138-42 

10. Scarparo C, Picolli P,Rigon A, Ruggiero G, Nista D, Piersimoni C.: Direct 

identification of mycobacteria from MB/BacTalert 3D bottles: comparative 

evaluation of two commercial probe assays. J Clin Microbiol (2001) Sep; 39(9): 

3222-27 

11. Schmidt E., Feldman K.: Clinical evaluation of BD Probe Tec ET System for 

direct detection of Mycobacterium tuberculosis from Clinical respiratory 

specimens.Abstr.M004, ESM 2000 

12. Wang S.X, Sng LH., Tay L.: Preliminary study on rapid identification of 

Mycobacterium tuberculosis complex isolates by the BD Probe Tec ET system. 

Journal of Medical Microbiology, 2004, 53; 57-59 

13. Woods GL.The mycobacteriology laboratory and new diagnostic techniques. 

Infect Dis Clin North Am. 2002 Mar;16(1):127-44 

14. Woods GL.: Molecular Techniques in Mycobacterial Detection. Arch Pathol 

Lab Med.2001; 125: 122-126 

106

NOTLAR 

107

NOTLAR 

108

NOTLAR 

109

NOTLAR 

110

NOTLAR 

111

NOTLAR 

112

V. TÃ¼berkÃ¼loz Lab. TanÄ± YÃ¶ntemleri Uyg. Kurs KitabÄ± - Klimik

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?