Yazdır

�zg�n �alışma/Original Article
Mikrobiyol Bul 2019; 53(2): 119-133

Gram Negatif Basillerin PhoenixTM FX Sistemi ile Pozitif Sinyal Veren
Kan K�lt�r� Şişelerinden Direkt Tanımlanması ve Antimikrobiyal Duyarlılıklarının Belirlenmesi

Direct Identification and Determination of Antimicrobial Susceptibility of Gram Negative Bacilli
Using the PhoenixTM FX System in Blood Cultures Flagging Positive

Yasemin GEN� BAH�E1, Alparslan TOYRAN2, Altan AKSOY2

1 Siirt Devlet Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Siirt.

1 Siirt State Hospital, Medical Microbiology Laboratory, Siirt, Turkey.

2 Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Ankara.

2 Ankara Numune Training and Research Hospital, Medical Microbiology Laboratory, Ankara, Turkey.

�Z

Kan dolaşımı enfeksiyonları d�nya genelinde morbidite ve mortalitenin artışından sorumlu olan başlıca hastalıklardan biridir. Mikrobiyolojik analizlerin tamamlanma s�relerinin kısaltılması morbidite, mortalite ve sağlık giderlerinin �nemli �l��de azalmasına neden olmaktadır. Bu �alışmada, bakteriyel sepsis d�ş�n�len hastalarda BD BACTEC� FX (Becton Dickinson, ABD) sisteminde pozitif sinyal veren kan k�lt�r� şişelerinden doğrudan bakteri tanımlanması ve ardından ger�ekleştirilen antibiyotik duyarlılık test sonu�larının Phoenix 100 (Becton Dickinson, Sparks, MD, ABD) cihazındaki performansını değerlendirmek ve bu y�ntemin raporlama s�resine etkisini araştırmak ama�lanmıştır. �alışmada 10.08.2015-05.12.2015 tarihleri arasında sepsis �n tanısı ile yatan hastalardan alınan kan k�lt�r� şişelerinden BD BACTEC� FX (Becton Dickinson, ABD) sisteminde pozitif sinyal veren ve Gram boyamada gram negatif basil ya da kokobasil g�r�len kan k�lt�r� şişeleri değerlendirilmiştir. �alışmamızda pozitif sinyal veren kan k�lt�r� şişelerinden Phoenix paneline doğrudan inok�lasyon yapılması işlemi "direkt Phoenix y�ntemi" olarak tanımlanmıştır. Pozitif sinyal veren kan k�lt�r� şişelerinden alınan �rneklerin BD Phoenix� (Becton Dickinson, ABD) otomatize mikrobiyoloji sistemi ve "Bruker Biotyper matrix-associated laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) (Bruker Daltonics, Almanya)" y�ntemleri karşılaştırılmış ve "direkt Phoenix y�ntemi"nin testin sonu�lanma s�resine etkisi ve konvansiyonel y�ntemlerle uyumu g�sterilmiştir. �alışmaya 95 adet Enterobacteriaceae ailesine ait basil ile 26 adet nonfermenter gram negatif bakteri (NFGNB) ve bir adet Aeromonas spp. olmak �zere toplam 122 gram negatif bakteri dahil edilmiştir. �alışmamızda Phoenix sistemi kullanarak gram negatif bakterileri doğrudan tanımlama ile sonu� raporlama s�resi inok�lasyondan sonra 2.25-7.84 saat aralığında (ortalama 2.56 saat) değişen s�rede tamamlanmıştır. Direkt Phoenix y�ntemi ile 122 gram negatif bakterinin tanımlanması, k�lt�rde �reme sonrası Maldi Biotyper (Bruker Daltonics, Almanya) ile yapılan tanımlama y�ntemi ile karşılaştırıldığında cins d�zeyinde %96.7 (118/122), t�r d�zeyinde %86.0 (105/122) oranında uyum g�stermiştir. Enterobacteriaceae ailesine ait 95 adet bakteri cins ve t�r d�zeyinde sırasıyla %95.7 (91/95) ve %93.6 (89/95) oranında Maldi Biotyper cihazı ile uyumlu tanımlanmıştır. NFGNB'ler (n= 26) ise sırasıyla %96.1 (25/26) ve %61.5 (16/26) oranında cins ve t�r d�zeyinde Maldi Biotyper cihazı ile uyumlu olarak tanımlanmıştır. �alışmamızda gram negatif basiller i�in direkt Phoenix y�ntemi ile antimikrobiyal duyarlılık test sonu�larının raporlanma s�resi inok�lasyondan sonra 7.42-15.85 saat aralığında (ortalama 12.9 saat) değişen s�rede tamamlanmıştır. �alışmamızda 120 gram negatif bakteri [Enterobacteriaceae ailesine ait izolat (n= 95) ve NFGNB izolatı (n= 25)] i�in 2159 antimikrobiyal ila� test edilmiştir. Hata oranı ise, k���k hata %2.0, b�y�k hata %1.1 ve �ok b�y�k hata %1.2 olmak �zere %4.4 (96/2.159) olarak belirlenmiştir. Antimikrobiyal duyarlılık testlerinde b�t�n kategorilerdeki hata oranı < %10, �ok b�y�k hata oranı < %1.5 ve b�y�k hata oranı < %3 olduğundan direkt Phoenix y�nteminin konvansiyonel olarak uygulanan Phoenix y�ntemi ile kabul edilebilir �l��de uyum g�sterdiği bulunmuştur. Bu �alışma, pozitif sinyal veren kan k�lt�r� şişelerinden alınan �rneğin direkt Phoenix y�ntemiyle �alışılması halinde gram negatif bakteri kaynaklı bakteriyemilerde bakteri tanımlama ve antibiyotik duyarlılıklarını belirleme s�relerini kısalttığını g�stermiştir. �alışmada elde edilen bu sonu� ile, hem hastaların erken klinik yarar sağlayabilmesi hem de hastane maliyetini azaltması a�ısından, kan k�lt�r şişesinden yapılan direkt y�ntemin yararlı olabileceğini d�ş�nmekteyiz.

Anahtar kelimeler: Kan k�lt�r�; gram negatif bakteri; hızlı tanımlama; antibiyotik duyarlılık testi; BD Phoenix sistemi.

ABSTRACT

Bloodstream infections are one of the main causes of morbidity and mortality worldwide. Shortening the turnover time of microbiological analysis leads to a significant reduction of patient morbidity, mortality and medical care expenses. This study aimed to evaluate the performance of Phoenix 100 Instrument (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) system in bacterial identification and the evaluation of antibiotic susceptibility directly taken from positive blood culture bottles in BD BACTEC� FX (Becton Dickinson, USA) system in patients with the suspicion of bacterial sepsis. In this study, blood culture bottles with a positive signal in BD BACTEC� FX (Becton Dickinson, USA) system, and in which gram negative bacilli or coccobacilli was observed in Gram staining were evaluated. In our study, direct inoculation to the Phoenix panel from the blood culture bottles giving positive signal was defined as "direct Phoenix method". The blood culture bottles which were taken from hospitalized patients with a suspicion of sepsis, were analyzed comparatively by using BD Phoenix� (Becton Dickinson, USA) automated microbiology system and "Bruker Biotyper matrix-associated laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)" (Bruker Daltonics, Germany) in the bottles of patients with the positive signals between August 10, 2015, and December 05, 2015. The effect of the "direct Phoenix method" on the duration of the test and the harmony with conventional methods was demonstrated. A total of 122 gram negative bacteria comprising 95 bacteria in Enterobacteriaceae family, 26 non-fermenting gram negative bacteria (NFGNB) and one Aeromonas spp. were included in the study. In our study, the reporting time of the identification of gram negative bacteria after inoculation with direct Phoenix method ranged from 2.25 hours to 7.84 hours (mean 2.56 hours). When the identification of 122 gram negative bacteria by direct Phoenix method was compared with the identification of Maldi Biotyper (Bruker Daltonics, Germany), an agreement was detected in 96.7% (118/122) of the samples at the genus level and in 86.0% (105/122) of the samples at the species level. Ninety-five bacteria belonging to Enterobacteriaceae family demonstrated an agreement of 95.7% (91/95) and 93.6% (89/95) at the genus and species levels with Maldi Biotyper respectively. Twenty-five NFGNB had an agreement of 96.1% (25/26) and 61.5% (16/26) at genus and species levels with Maldi Biotyper respectively. In our study, the reporting time of antibiotic susceptibility test results of gram negative rods after direct Phoenix method ranged from 7.42 hours to 15.85 hours (mean 12.9 hours). In our study, 2.159 antimicrobial agents were tested for 120 gram negative bacteria (95 strains belonging to Enterobacteriaceae family and 25 NFGNB). Minor error rate was found to be 2.0% with the direct Phoenix method, 1.1% major error rates, and 1.2% very major error rates; making a total of 4.4% (96/2.159). Since error rates in all categories < 10%, very major error rate was < 1.5% and major error rate was < 3%, the direct Phoenix method had an acceptable agreement with the conventional Phoenix method. The direct inoculation of the Phoenix system with culture suspension obtained from positive blood culture bottles decreased reporting time of the identification and determination of the antibiotic susceptibilities for gram negative rods that cause bacteraemia. This result could be important in the clinical benefits for the patients as well as financial savings for the hospital.

Keywords: Blood culture; gram negative bacteria; rapid identification; antibiotic susceptibility test; BD Phoenix system.

Geliş Tarihi (Received): 16.08.2018 - Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 06.02.2019

GİRİŞ

Sepsis, gelişen tedavi y�ntemlerine rağmen y�ksek mortalite ile seyreden bir hastalık olma �zelliğini korumaktadır1. �zellikle gram negatif mikroorganizmalardan kaynaklanan bakteriyemik enfeksiyonlarda hızlı ve uygun ampirik tedavinin başlanmadığı durumlarda mortalitenin �nemli oranlarda arttığı g�zlenmiştir2,3.

Sepsisin mikrobiyolojik tanısında kan k�lt�rleri anahtar role sahip olmakla birlikte etkinliği istenilen d�zeyde değildir. Bazı hastalarda �reme sağlanamamakta ve sonu�ların en az 48 saat sonra verilmesi nedeniyle hastalara ampirik tedavi başlanmaktadır4.

G�n�m�zde mikroorganizma tanısında ve antibiyotik duyarlılık testlerinde �eşitli otomatize sistemler kullanılmaktadır. Bu sistemlerde tanımlama k�lt�rde �reme olduktan 24 saat sonra yapılmaktadır. Sepsis gibi acil tanı ve tedavi gerektiren durumda tanı i�in geciken her saat mortalite oranını %10-20 oranında arttırmaktadır5. Ayrıca, bu durum hastanede kalma s�resini ve maliyeti �nemli �l��de olumsuz y�nde etkilemektedir6.

G�n�m�zde kullanılan otomatize kan k�lt�r sistemlerindeki gelişmelere rağmen kan k�lt�r�n�n teknik sınırlamaları ortadan kaldırılmış değildir. Buna ek olarak, sepsiste mikrobiyolojik tanıya katkı sağlamak �zere kan k�lt�r�ne ek hızlı tanı testlerinin geliştirilmesi ve mikrobiyoloji tanı laboratuvarlarında kullanımlarının farklı hasta gruplarında araştırılmasına gereksinim vardır7. Hızlı tanı i�in n�kleik asit probları ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi �eşitli molek�ler teknikler geliştirilmesine rağmen, hala en duyarlı ve g�venilir y�ntem kan k�lt�r�d�r8,9.

Bu �alışmada, bakteriyel sepsis d�ş�n�len hastalarda pozitif kan k�lt�r� şişelerinden doğrudan bakteri t�r tanımlamasında ve bakteri t�r�ne ait antibiyotik duyarlılık test (ADT)'inde BD Phoenix (Becton Dickinson, ABD) sisteminin performansını değerlendirmek ve raporlama s�resini ne kadar kısalttığını g�stermek ama�lanmıştır.

GERE� ve Y�NTEM

Bu �alışma, 10.08.2015-05.12.2015 tarihleri arasında prospektif olarak ger�ekleştirildi. �alışmaya, sepsis �n tanısı konulan hastalardan alınan kan k�lt�r� şişelerinden BD BACTEC� FX (Becton Dickinson, ABD) otomatize kan k�lt�r� sisteminde pozitif �reme sinyali veren, sonrasında Gram boyamada gram negatif bakteri g�r�len ve pasajında tek bir patojen �reme tespit edilen kan k�lt�r� şişeleri dahil edildi. �alışmada bir gecelik ink�basyon sonrası birden fazla etken �remesi g�zlenen �rnekler polimikrobiyal k�lt�rlerden kaynaklanabilecek hataların dışlanması amacıyla analize dahil edilmedi. T�m veriler yalnız monomikrobik kan k�lt�r �remesi olan �rneklerde ger�ekleştirildi.

Pozitif Sinyal Veren Kan K�lt�r�nden Phoenix Panel İnok�lasyonu

Hastanemiz merkez laboratuvarına g�nderilen kan k�lt�r� şişeleri rutin olarak BD BACTEC� FX (Becton Dickinson, ABD) kan k�lt�r� cihazında 37oC'de beş g�n ink�be edildi. Pozitif sinyal veren kan k�lt�rlerinden Gram boyama yapılarak direkt mikroskobik inceleme yapıldı. Buna g�re �reme sinyali alınan kan k�lt�r� şişelerinden 1 ml �rnek kanlı agar, MacConkey agar ve Gram boyama sırasında fungal eleman g�r�lmesi halinde ise Sabouraud dekstroz agar (SDA)'a ekim yapılarak 37oC'de 24-48 saat ink�be edildi. �reyen mikroorganizmaların tanımlanması i�in Maldi Biotyper (Bruker Daltonics, Almanya) veya Phoenix 100 cihazı (Becton Dickinson, Sparks, MD, ABD) kullanıldı. Etken olduğu d�ş�n�len mikroorganizmaların antibiyotik duyarlılık testleri Phoenix 100 cihazı (Becton Dickinson, Sparks, MD, ABD) ile ger�ekleştirildi. Toplam beş g�nl�k ink�basyon sonunda sinyal vermeyen kan k�lt�rleri negatif olarak kabul edildi. �alışmamıza dahil ettiğimiz b�t�n �rnekler �retici firma �nerileri doğrultusunda konvansiyonel Phoenix y�ntemi ile �alışıldı ve Maldi Biotyper (Bruker Daltonics, Almanya) ile tanımlandı.

Pozitif Sinyal Veren Kan K�lt�r�nden Doğrudan Phoenix Panel İnok�lasyonu (Direkt Phoenix Y�ntemi)

�alışmaya dahil edilen kan k�lt�r� şişeleri �ncelikle hafif�e �alkalandıktan sonra "vacutainer holder" ile serum ayırma t�p�ne (SST) 8.5 ml aspire edildi. Daha sonra SST t�p� 10 dakika 2000 xg'de santrif�j edildi. T�pteki s�pernatan d�k�ld�kten sonra jelin alt kısmında bulunan bakteri 0.5-1.0 ml "Bakteri tanımlama buyyon (ID broth)"u ile s�spanse edilerek McFarland 0.5 bulanıklığında ayarlandı. ADT'yi ger�ekleştirmek i�in 40 �l antimikrobiyal duyarlılık test (AST) indikat�r� bulunan "AST buyyonu (AST broth)"na 25 �l kadar tanımlama buyyonu eklenip hafif�e karıştırılarak hazırlanan buyyon, "GN Phoenix Combo" paneline inok�le edildi. İnok�lasyon panelleri 30 dakika i�erisinde Phoenix cihazına yerleştirildi. Tanımlama buyyonu, katı besiyerine pasaj yapılarak s�spansiyonda bakteri olup olmadığı kontrol edildi. �alışmamızda pozitif sinyal veren kan k�lt�r� şişelerinden Phoenix paneline doğrudan inok�lasyon yapılması "direkt Phoenix y�ntemi" olarak tanımlandı.

Pozitif Sinyal Veren Kan K�lt�r�nden "Matrix-associated Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)" ile Tanımlama

Y�ntemin uygulanması sonrasında elde edilen spektrumlar "Maldi Biotyper software version 3.0" (Bruker Daltonics, Almanya) ile analiz edildi. Spektrum skorları ≥ 2.0 olan tanımlamalar t�r d�zeyinde g�venilir, 1.70-1.99 olanlar cins d�zeyinde g�venilir olarak tanımlandı. Skorları < 1.70 olan tanımlar g�venilir kabul edilmedi.

�alışmamızda direkt Phoenix y�nteminden elde edilen bakteriyel tanımlama ve duyarlılık testlerinin verileri, konvansiyonel Phoenix y�nteminden elde edilen verilerle karşılaştırıldı. �alışmaya alınan izolatlar "doğru tanımlanmış", "cins d�zeyinde doğru tanımlanmış", "t�r d�zeyinde doğru tanımlanmış", "yanlış tanımlanmış" ve "tanımlanmamış" olarak sınıflandırıldı.

B�t�n izolatlar i�in test edilen duyarlılık sonu�ları Phoenix 100 cihazının (Becton Dickinson, Sparks, MD, ABD) uzman �nerilerine g�re duyarlı, orta duyarlı ve diren�li olmak �zere �� klinik kategoriye ayrıldı. Tutarlılık ve farklılıklar; i) uyumlu (aynı klinik kategori), ii) �ok b�y�k hata (yanlış duyarlılık), iii) b�y�k hata (yanlış diren�), iv) k���k hata (orta duyarlı sonucun duyarlı/diren�li raporlanması) şeklinde sınıflandırıldı.

Enterobacteriaceae ailesine ait her bir bakteri i�in toplam 19 antimikrobiyal ila� konvansiyonel ve direkt Phoenix y�ntemiyle �alışıldı. Bu antibiyotikler; amikasin, amoksisilin-klavulanik asit, ampisilin, aztreonam, sefepim, seftazidim, seftriakson, sefuroksim, siprofloksasin, kolistin, ertapenem, gentamisin, imipenem, meropenem, netilmisin, piperasilin, piperasilin-tazobaktam, tigesiklin ve trimetoprim-s�lfametoksazol olarak belirlendi. Cihaza y�klenen ADT panellerindeki antibiyotik kuyucuklarında �reme olmaması halinde minimum inhibit�r konsantrasyonu (MİK) sonu�ları değerlendirme dışı bırakıldı.

Laboratuvarımızda kullanılan Phoenix cihazı ile ger�ekleştirilen AST sonucunda elde edilen MİK değerleri EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) 2015 �nerilerine g�re yorumlandı10.

BULGULAR

�alışmaya 95 adet Enterobacteriaceae, 26 adet nonfermenter gram negatif bakteri (NFGNB) ve bir adet Aeromonas spp. olmak �zere toplam 122 gram negatif bakteri dahil edilmiştir. �alışmada polimikrobiyal �reme olan 14 klinik �rnek �alışma dışı bırakılmıştır. �alışmaya dahil edilen 122 klinik �rneğin 89 (%72.9)'u aerobik kan k�lt�r� şişelerinde, 33 (%27.0)'� anaerobik kan k�lt�r� şişelerinde �reme g�stermiştir.

Maldi Biotyper ile toplam 122 gram negatif bakterinin 14 (%11.4)'� < 2.0 g�ven skoru ile cins d�zeyinde g�venilir olarak tanımlanmıştır. Geriye kalan 108 (%88.5) bakteri ≥ 2.0 skoru ile t�r d�zeyinde g�venilir olarak tanımlanmıştır. Escherichia spp.'de 5 (%9.4), Klebsiella spp.'de 2 (%7.6), Pseudomonas spp.'de 1 (%14.2), Enterobacter spp.'de 3 (%33.3), Acinetobacter spp.'de 5 (%20.0) izolat cins d�zeyinde g�venilir olarak tanımlanmıştır. Hi�bir izolat Maldi Biotyper ile g�venilir olmayan aralıkta (< 1.7 skor) tanımlanmamıştır.

�alışmamızdaki gram negatif bakterilerin direkt Phoenix y�ntemi ile tanımlanma s�resi inok�lasyondan sonra 2.25-7.84 saat aralığında (ortalama 2.56 saat) olarak belirlenmiştir.

�alışmaya dahil edilen bakterilerin tanımlanmasında direkt Phoenix y�ntemi ve konvansiyonel Phoenix y�nteminin doğruluğu, kan k�lt�r� pasajlarından Maldi Biotyper ile yapılan tanımlamalarla ayrı ayrı karşılaştırılmıştır. Konvansiyonel Phoenix y�ntemi ile 122 gram negatif bakterinin tanımlamasında Maldi Biotyper cihazı ile kan k�lt�r pasajından yapılan tanımlamayla karşılaştırıldığında cins d�zeyinde %100 (122/122), t�r d�zeyinde ise %90.9 (111/122) oranında kabul edilebilir d�zeyde uyum olduğu g�zlenmiştir. Enterobacteriaceae ailesine ait bakteriler ile NFGNB'ler ayrı ayrı değerlendirildiğinde, Enterobacteriaceae ailesine ait bakteriler (n= 95) sırasıyla %100 (95/95) ve %94.7 (90/95) oranında cins ve t�r d�zeyinde Maldi Biotyper cihazı ile uyumlu olarak tanımlanmıştır. NFGNB izolatları (n= 25) ise sırasıyla %100 (26/26) ve %80.7 (21/26) oranında cins ve t�r d�zeyinde Maldi Biotyper cihazı ile uyumlu tanımlanmıştır. Aeromonas cinsi tek bir izolat konvansiyonel Phoenix y�ntemiyle Aeromonas sobria, kan k�lt�r pasajından Maldi Biotyper y�ntemi ile Aeromonas veroni olarak tanımlanmıştır.

�alışmaya dahil edilen 122 gram negatif bakterinin tanımlanmasında direkt Phoenix y�ntemi, Maldi Biotyper cihazı ile kan k�lt�r pasajından yapılan tanımlamayla karşılaştırıldığında cins d�zeyinde %96.7 (118/122), t�r d�zeyinde %86.0 (105/122) oranında uyum olduğu tespit edilmiştir. Enterobacteriaceae ailesine ait bakteriler (n= 95) cins ve t�r d�zeyinde sırasıyla %95.7 (91/95) ve %93.6 (89/95) oranında Maldi Biotyper cihazı ile uyumlu tanımlanmıştır. NFGNB izolatları (n= 25) ise sırasıyla %96.1 (25/26) ve %61.5 (16/26) oranında cins ve t�r d�zeyinde Maldi Biotyper cihazı ile uyumlu olarak tanımlanmıştır.

�alışmamızda direkt Phoenix y�ntemi ile tanımlanan 122 gram negatif bakterinin 118 (%96.7)'i cins d�zeyinde doğru tanımlanmıştır. D�rt izolat ise direkt Phoenix y�ntemi ile yanlış tanımlanmıştır. Direkt Phoenix y�ntemi ile yanlışlıkla Pantoea aglomerans olarak tanımlanan izolat konvansiyonel Phoenix y�ntemi ve Maldi Biotyper ile yapılan tanımlamalarda Acinetobacter baumannii olarak tanımlanmıştır. Direkt Phoenix y�ntemi ile Serratia fonticola ve Citrobacter braaki olarak tanımlanan izolatlar ise Maldi Biotyper cihazında Enterobacter cloacae, konvansiyonel Phoenix y�ntemiyle ise sırasıyla Enterobacter cloacae ve Enterobacter aerogenes olarak tanımlanmıştır. Direkt Phoenix y�ntemiyle Kluyvera ascorbata olarak tanımlanan izolat diğer iki y�ntemle de Escherichia coli olarak tanımlanmıştır. �alışmamızdaki 26 adet NFGNB'nin 25 (%96.1)'i cins d�zeyinde �� y�ntemle de aynı t�r olarak tanımlanmıştır (Tablo I).


Tablo I

�alışmamızda gram negatif basiller i�in direkt Phoenix y�ntemiyle antibiyotik duyarlılık testi sonu�larının raporlanma s�resi inok�lasyondan sonra 7.42-15.85 saat aralığında (ortalama 12.9 saat) olarak belirlenmiştir.

�alışmamızda 120 gram negatif bakteri [Enterobacteriaceae ailesine ait izolat (n= 95) ve NFGNB (n= 25)] i�in direkt Phoenix y�ntemiyle 2159 antimikrobiyal ila� test edilmiştir ve konvansiyonel Phoenix y�ntemi ile karşılaştırılmıştır (Tablo II). Genel olarak b�t�n antimikrobiyal ila�lar i�in kategorik uyum %95.5 oranında tespit edilmiştir. Amikasin, ampisilin, aztreonam, seftazidim, seftriakson, sefuroksim, siprofloksasin, kolistin, gentamisin, netilmisin ve piperasilin-tazobaktam i�in sonu� verilen ADT'lerde b�t�n kategorilerdeki hata oranı < %10, �ok b�y�k hata oranı < %1.5 ve b�y�k hata oranı < %3 olduğundan konvansiyonel Phoenix y�ntemi ile kabul edilebilir d�zeyde uyum g�sterdiği bulunmuştur (Tablo II).


Tablo II

�alışmamızdaki Enterobacteriaceae ailesine ait 95 gram negatif bakterinin 19 antimikrobiyal ilaca karşı duyarlılıkları test edilmiştir. Toplamda 1792 antimikrobiyal ila� �alışılmıştır. Bunların %95.9 (1.719/1.792)'u kategorik uyum g�stermiştir. Genel olarak %1.8 (34/1.792) k���k hata, %1.0 (19/1.792) b�y�k hata ve %1.1 (20/1.792) �ok b�y�k hata olmak �zere %4.0 (73/1.792) hata oranı bulunmuştur (Tablo III).


Tablo III

GN Phoenix Combo panelindeki antimikrobiyal maddelerden yalnızca siprofloksasin ve gentamisin 95 adet Enterobacteriaceae izolatı i�in tamamen kategorik uyum g�stermiştir. Amikasin, ampisilin, aztreonam, sefepim, seftazidim, seftriakson, sefuroksim, siprofloksasin, kolistin, gentamisin, imipenem ve netilmisin i�in kabul edilebilir ADT kategorik uyumu bulunmuştur.

�alışmamızdaki 122 gram negatif bakteride konvansiyonel Phoenix y�ntemi ile 35 izolatta, direkt Phoenix y�ntemi ile 37 izolatta diren� paterni [genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) ve potansiyel karbapenemaz �retimi (PKP)] saptanmıştır. Direkt Phoenix y�nteminde diren� paterni olan 37 izolatın 31 (%83.7)'i konvansiyonel Phoenix y�ntemiyle uyumlu tanımlanmıştır. Bunlardan direkt Phoenix y�ntemi raporlarının GSBL uyumu %88.8 (24/27)'dir. Direkt Phoenix y�ntemi ile GSBL �rettiği belirlenen izolatların ADT sonu�ları konvansiyonel Phoenix y�ntemiyle karşılaştırıldığında amikasin, ampisilin, seftriakson, sefuroksim, siprofloksasin, meropenem ve piperasilin i�in klinik kategoride %100 uyum saptanmıştır. Piperasilin-tazobaktam dışındaki b�t�n antibiyotikler i�in %90'ın �zerinde kategorik uyum bulunmuştur. Yirmi d�rt GSBL �reten izolat i�in değerlendirilen 454 antimikrobiyal ila�ta %2.6 k���k hata, %0.8 b�y�k hata ve %0.8 �ok b�y�k hata olmak �zere %4.4 hata oranı ve %95.5 kategorik uyum g�sterilmiştir.

�alışmamızda NFGNB'de (n= 25) (Burkholderia cepacia kompleks hari�) 367 antimikrobiyal ila� test edilmiştir. Bu bakteriler i�in direkt ve konvansiyonel Phoenix y�ntemlerinin antibiyotik duyarlılık test sonu�ları %93.7 (344/367) oranında uyum g�stermiştir. Amoksisilin-klavulanik asit, ampisilin, seftazidim, seftriakson, sefuroksim, kolistin, gentamisin, piperasilin-tazobaktam ve tigesiklin ADT klinik kategorilerinde %100 uyum bulunmuştur (Tablo IV).


Tablo IV

TARTIŞMA

Otomatize sistemler, kan dolaşımındaki bakterilerin tanımlanması ve antibiyotik duyarlılık testleri i�in yıllardır kullanılmaktadır11. Ancak bu sistemlerde kullanılan k�lt�r sistemine dayalı tanı kan k�lt�r�nden katı besiyerine yapılan pasajın 18-24 saat ink�basyonu nedeniyle zaman alıcıdır. Raporlama s�resini kısaltmak i�in pozitif kan k�lt�r� şişelerinden direkt inok�lasyonun uygulamasını g�steren �eşitli �alışmalar mevcuttur, bu �alışmaların �oğu tanımlama ve ADT sonu�ları a�ısından gram negatif bakterilerin %80'den fazla oranda doğru tanımlandığını ve %3'ten az oranda b�y�k hata verdiğini, sonu�ların kabul edilebilir doğrulukla rapor verme s�resini kısalttığını g�stermektedir. Ne var ki, gram pozitif koklar i�in yapılan �alışmalar nispeten başarısız sonu�lar vermiştir12-14.

Japonya'da yapılan bir �alışmada direkt Phoenix y�ntemi ile 101 gram negatif bakterinin %99 (100/101)'u cins d�zeyinde, 97 (98/101)'si t�r d�zeyinde doğru olarak tanımlanmıştır15. Hazelton ve arkadaşları16 64 gram negatif bakterinin 63 (%98.4)'�nde pozitif kan k�lt�r� şişelerinden doğrudan MALDI TOF ile tanımlamanın k�lt�rden pasaj ile �retme sonucu Phoenix cihazı ile yapılan tanımlamayla t�r d�zeyinde uyumlu olduğunu bulmuşlardır. Lee ve arkadaşları17 iki farklı �rnek hazırlama y�ntemi [saponin y�ntemi (SAP) ve (saponin + Sputazyme) y�ntemi (SSPZ)] kullanarak MALDI-TOF MS ile 64 gram negatif izolatı direkt kan k�lt�r� şişelerinden SAP y�ntemi ve SSPZ y�ntemi ile sırasıyla %82.8, %87.5 oranında doğru olarak tanımlamışlardır. Maelegheer ve arkadaşları14 Maldi Biotyper kullanarak �alıştıkları direkt tanımlama sonu�larını gram negatif bakteriler i�in %97 (44/45) oranında mikrobiyoloji tanı laboratuvarı sonu�ları ile uyumlu bulmuşlardır. Doğrudan pozitif kan k�lt�r� şişelerinden �alışılan gram negatif bakterilerin tanımlanmasındaki doğruluk oranları daha �nceki �alışmalarda da benzer d�zeyde bulunmuştur18-20. �alışmamızda da diğer �alışmalara benzer olarak gram negatif bakterilerin tanımlamasında y�ntemler arasında cins ve t�r d�zeyinde y�ksek oranda uyum bulunmuştur.

Ling ve arkadaşları21 VİTEK 2 cihazı ile yaptıkları direkt inok�lasyon y�ntemini kullandıkları �alışmada 89 NFGNB ve 173 Enterobacteriaceae �yesi bakterinin t�r d�zeyinde doğru tanımlanma oranlarını sırasıyla %91.1 ve %97.1 olarak saptamışlardır. Brezilya'da 2018 yılında VİTEK 2 cihazı ile direkt kan k�lt�r� şişelerinden yapılan bir �alışmada yedi NFGNB ve 30 Enterobacteriaceae �yesi bakteri t�r d�zeyinde %100 oranında rutin VİTEK 2 cihazı y�ntemi ile uyumlu tanımlanmıştır22. Bizim �alışmamıza dahil ettiğimiz gram negatif bakteriler, Enterobacteriaceae ailesine ait bakteriler ve NFGNB'ler olarak ayrı ayrı değerlendirildiğinde, direkt Phoenix y�ntemi ile 95 Enterobacteriaceae ailesine ait bakteri cins ve t�r d�zeyinde sırasıyla %95.7 (91/95) ve %93.6 (89/95) oranında Maldi Biotyper cihazı ile uyumlu olarak tanımlanmıştır. Yirmi altı NFGNB ise sırasıyla %96.1 (25/26) ve %61.5 (16/26) oranında cins ve t�r d�zeyinde Maldi Biotyper cihazı ile uyumlu olarak tanımlanmıştır.

Bakteri tanımlaması i�in yeni bir y�ntem se�erken, referans sistemle en azından %90 tam uyum g�steren ve yaygın olarak izole edilen mikroorganizmaları en az %95 doğrululukla tanımlayan sistemler �nerilmektedir23. �alışmamızda elde edilen bakteri tanımlama sonu�larını bu doğrultuda değerlendirdiğimizde, direkt Phoenix y�ntemiyle yapılan tanımlamanın kabul edilebilirliği umut verici bulunmuştur.

Direkt inok�lum y�ntemi ile bakteri tanımlamasındaki hatanın en b�y�k nedeni standardize olmayan inok�lum miktarıdır. Kan k�lt�r� şişelerindeki d�ş�k bakteri inok�lum miktarları (3-9 ml) daha �nceki �alışmalarda bildirilen direkt tanımlamalardaki y�ksek hata oranlarının nedeni olabilir15.

Hatanın diğer bir nedeni ise polimikrobiyal kan k�lt�rleridir. Başlangı�ta yapılan Gram boyamada monomikrobiyal g�r�len �rneklerin %6-10'unda pasajlarda polimikrobiyal �remeler bildirilmiştir13.

�alışmamızda pasajlarda �reyen kolonilerin Maldi Biotyper ile yapılan tanımlaması altın standart olarak kabul edilmiştir. Uyumsuz tanımlamaların dizi analizi gibi altın standart bir y�ntemle doğrulanması sonu�ların daha doğru yorumlanmasına katkıda bulunabilirdi.

�alışmamızda direkt Phoenix y�ntemiyle gram negatif bakteriler ortalama 2.56 saatte tanımlanmıştır. Bu s�re pozitif kan k�lt�r� şişelerinin konvansiyonel Phoenix y�ntemiyle tanımlanmasında iki g�ne kadar uzamaktadır24,25. Direkt Phoenix y�ntemi ile antimikrobiyal duyarlılık sonu�ları ortalama ink�basyondan 12.9 saat sonra sonu�lanmıştır. Direkt Phoenix y�ntemi uygun tedaviye konvansiyonel y�ntemlerden 1-2 g�n �nce başlanmasına ve daha iyi hasta y�netimine olanak sağlamaktadır24,25. Direkt Phoenix y�ntemindeki ek prosed�r y�ntemin s�resini yaklaşık olarak yarım saat uzatmaktave maya gibi uygun olmayan �rnekleri dışlamak i�in işlem �ncesi her zaman Gram boyama yapılmasında fayda bulunmaktadır. Ayrıca, direkt Phoenix y�nteminde kullanılan test t�p�n�n maliyeti konvansiyonel Phoenix y�nteminde kullanılan kanlı agar maliyeti ile hemen hemen aynıdır. Bu y�zden direkt Phoenix y�nteminin toplam maliyeti ile konvansiyonel Phoenix y�nteminin toplam maliyeti arasında �nemli bir fark yoktur.

Munoz-D�vila ve arkadaşları26 VİTEK 2 otomatize sistemi ile yaptıkları direkt inok�lasyon y�ntemi ile 142 gram negatif bakteri i�in 2414 antimikrobiyal ilacı test etmişlerdir. Munoz-D�vila ve arkadaşları26 bu �alışmalarında %0.6 (14/2.414)'sı �ok b�y�k hata, %0.1 (3/2.414)'i b�y�k hata ve %2.0 (50/2.414)'ı k���k hata olmak �zere genel olarak %2.8 (67/2.414) oranında hata oranı ve %97.4 (2.352/1.414) oranında tam kategorik uyum saptamışlardır. İtalya'da 2015 yılında direkt Phoenix y�ntemi ile yapılan bir �alışmada, 78 adet gram negatif bakterinin ADT sonu�ları bildirilmiş ve 1017 adet izolat/antimikrobiyal ila� kombinasyonu i�in değerlendirme yapılmıştır27. Yine bu �alışmada %0.1 �ok b�y�k hata, %1.5 b�y�k hata ve %2.4 k���k hata olmak �zere genel olarak %4 hata oranı tespit edilmiştir27. Barman ve arkadaşları28 gram negatif bakteri i�eren 100 monomikrobiyal kan k�lt�r� şişesinde VİTEK 2 cihazı kullanarak, direkt ADT sonu�larını konvansiyonel ADT sonu�ları ile karşılaştırdıklarında %99.74 oranında kategorik uyum bulmuşlardır. Lemos ve arkadaşları22 VİTEK 2 otomatize sistemini kullanarak, kan k�lt�rlerindeki 37 gram negatif bakterinin konvansiyonel ve direkt y�ntemle �alışılan ADT sonu�ları arasında %95 oranında uyum bulmuşlardır. Bu �alışmada gram negatif bakterilerin ADT sonu�larındaki k���k hata oranı %2.3, b�y�k hata oranı %1.1 ve �ok b�y�k hata oranı %1.6 olarak saptanmıştır22. �alışmamızda ise 120 gram negatif bakteri i�in 2159 antimikrobiyal ila� test edilmiştir. B�t�n antimikrobiyal ila�lar i�in %95.5 oranında kategorik uyum bulunmuştur. �alışmamıza dahil ettiğimiz bakteriler i�in raporlanan ADT'lerde b�t�n kategorilerdeki hata oranı < %10, �ok b�y�k hata oranı < %1.5 ve b�y�k hata oranı < %3 olduğundan kabul edilebilir sonu�ları elde edilmiştir.

�alışmamızda, GSBL �reten izolatların tedavisinde tercih edilen karbapenemlerin kategorik uyumu imipenem i�in %91.6, meropenem i�in %100 bulunmuştur. İmipenem sonu�larında bu izolatlar i�in sadece %8.3 oranında min�r hata saptanmıştır. Bu sonu�lar diren�li izolatların erken ve uygun tedavi edilmesi a�ısından sevindiricidir. Daha geniş �alışmalarla desteklenmelidir.

Yonetania ve arkadaşları15 2012 yılında yaptıkları �alışmada BD Phoenix sisteminin direkt inok�lasyon y�ntemi ile Enterobacteriaceae ailesine ait 78 adet gram negatif bakterinin 21 antimikrobiyal ilaca karşı duyarlılıklarını test etmiş ve bu bakterilerde %99.5 oranında kategorik uyum saptamışlardır. Aynı �alışmada 23 adet NFGNB i�in test edilen 20 antimikrobiyal ilaca duyarlılık sonu�ları %91.1 kategorik uyum, %0.2 k���k hata olarak belirlenmiştir ve izolatların %8.7'sinde duyarlılık tespit edilememiştir15. �alışmamızda ise Enterobacteriaceae ailesine ait 95 adet gram negatif bakterinin 19 antimikrobiyal ilaca duyarlılıkları test edilmiştir. Amikasin, ampisilin, aztreonam, sefepim, seftazidim, seftriakson, sefuroksim, siprofloksasin, kolistin, gentamisin, imipenem ve netilmisin i�in kabul edilebilir ADT kategorik uyumu bulunmuştur.

�alışmamızda NFGNB'lerin ADT sonu�larında sefepim dışındaki sefalosporinler, ampisilin, amoksisilin-klavulanik asit, piperasilin-tazobaktam ve �ok ilaca diren�li izolatların tedavisinde tercih edilen tigesiklin ve kolistin i�in %100 klinik kategorik uyum bulunması sepsis hastalarının erken ve doğru tedavisi i�in umut vericidir. Bunun yanı sıra Pseudomonas enfeksiyonlarında ilk tercih olan seftazidim antibiyotiği i�in %100 kategorik uyum bulunması anlamlıdır.

�alışmamızda antimikrobiyal ila� duyarlılığının belirlenmesinde sadece otomatize Phoenix sistemi kullanılmıştır. Direkt ve konvansiyonel Phoenix y�ntemi ile uyumsuz �ıkan kolistin duyarlılık sonu�ları sıvı mikrodil�syon y�ntemiyle doğrulanmamıştır. Kolistin i�in kategorik uyum oranları otomatize Phoenix sisteminin ADT sonu�larına g�re belirlenmiştir.

�alışmamızda kullanılan direkt Phoenix y�ntemi ile gram negatif bakterilerin tanımlama ve ADT'lerinin konvansiyonel Phoenix y�ntemi ile y�ksek uyumu, direkt Phoenix y�nteminin tanısal mikrobiyoloji laboratuvarlarında kabul edilebilir olduğunu g�stermiş ve �alışmanın sonu�ları Phoenix sisteminin katı besiyerine pasaj y�ntemi ile karşılaştırılmıştır. Direkt Phoenix y�ntemi gram negatif basil kaynaklı bakteriyemilerde bakterilerin tanımlanmasını ve antibiyotik duyarlılıklarının raporlanma s�resini en az 18-24 saat kısaltmıştır. Bu sonu�, kan k�lt�r şişesinden yapılan direkt y�ntemin hem hastaların erken klinik yarar sağlayabilmesi hem de hastane maliyetlerini azaltması a�ısından yararlı olabileceğini g�stermektedir.

�IKAR �ATIŞMASI

Yazarlar bu makale ile ilgili herhangi bir �ıkar �atışması bildirmemişlerdir.

KAYNAKLAR

  1. Karaali R, Tabak F. Sepsis patogenezi. Klinik Gelişim Dergisi 2009;22:71-6.
  2. Karlowsky JA, Jones ME, Draghi DC, Thornsberry C, Sahm DF, Volturo GA. Prevalance and antimicrobial susceptibilities of bacteria isolated from blood cultures of hospitalized patients in the United States in 2002. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2004;10:3-7.
  3. Zilberberg MD, Shorr AF, Micek ST, Vazquez-Guillamet C, Kollef MH. Multi-drug resistance, inappropriate initial antibiotic therapy and mortality in gram-negative severe sepsis and septic shock: a retrospective cohort study. Crit Care 2014;18(6):596.
  4. Doğanay M, Alp Meşe E. Sepsis, pp. 877-97. In: Willke Top�u A, S�yletir G, Doğanay M (eds). Enfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi kitabı. 2008, 3. baskı. Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul.
  5. Kumar A, Roberts D, Wood KE, Light B, Parrillo JE, Sharma S, et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med 2006;34(6):1589-96.
  6. Beekmann SE, Diekema DJ, Chapin KC, Doern GV. Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges. J Clin Microbiol 2003;41(7):3119-25.
  7. Karako� AE. G�ncel rehberler ışığında sepsis, klasik ve hızlı tanı y�ntemler, ulusal hemok�lt�r rehberi. ANKEM Derg 2014;28(Ek 2):46-51.
  8. Ntusi N, Aubin L, Oliver S, Whitelaw A, Mendelson M. Guideline for the optimal use of blood cultures. S Afr Med J 2010;100(12):839-43.
  9. Chiarini A, Palmeri A, Amato T, Immordino R, Distefano S, Giammanco A. Detection of bacterial and yeast species with the Bactec 9120 automated system with routine use of aerobic, anaerobic, and fungal media. J Clin Microbiol 2008;46(12):4029-33.
  10. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, version 5.0, 2015.
  11. Trenholme GM, Kaplan RL, Karakusis PH, Stine T, Fuhrer J, Landau W, et al. Clinical impact of rapid identification and susceptibility testing of bacterial blood culture isolates. J Clin Microbiol 1989;27(6):1342-5.
  12. Beuving J, van der Donk CF, Linssen CF, Wolffs PF, Verbon A. Evaluation of direct inoculation of the BD PHOENIX system from positive BACTEC blood cultures for both gram-positive cocci and gram-negative rods. BMC Microbiol 2011;11:156.
  13. Waites KB, Brookings ES, Moser SA, Zimmer BL. Direct bacterial identification from positive BacT/Alert blood cultures using MicroScan overnight and rapid panels. Diagn Microbiol Infect Dis 1998;32(1):21-6.
  14. Maelegheer K, Nulens E. Same-day identification and antibiotic susceptibility testing on positive blood cultures: a simple and inexpensive procedure. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2017;36(4):681-7.
  15. Yonetani S, Okazaki M, Araki K, Makino H, Fukugawa Y, Okuyama T, et al. Direct inoculation method using BacT/ALERT 3D and BD Phoenix System allows rapid and accurate identification and susceptibility testing for both gram-positive cocci and gram-negative rods in aerobic blood cultures. Diagn Microbiol Infect Dis 2012;73(2):129-34.
  16. Hazelton B, Thomas LJ, Olma T, Kok J, O'Sullivan M, Chen SC, et al. Rapid and accurate direct antibiotic susceptibility testing of blood culture broths using MALDI Sepsityper combined with the BD Phoenix automated system. J Med Microbiol 2014;63(Pt 12):1590-4.
  17. Lee JE, Jo SJ, Park KG, Suk HS, Ha SI, Shin JS, et al. Evaluation of modified saponin preparation method for the direct identification and antimicrobial susceptibility testing from positive blood culture. J Microbiol Methods 2018;154:118-23.
  18. Buchan BW, Riebe KM, Ledeboer NA. Comparison of the MALDI Biotyper system using Sepsityper specimen processing to routine microbiological methods for identification of bacteria from positive blood culture bottles. J Clin Microbiol 2012;50(2):346-52.
  19. Moussaoui W, Jaulhac B, Hoffmann AM, Ludes B, Kostrzewa M, Riegel P, et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect 2010;16(11):1631-8.
  20. Stevenson LG, Drake SK, Murray PR. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization�time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 2010;48(2):444-7.
  21. Ling TK, Tam PC, Liu ZK, Cheng AF. Evaluation of VITEK 2 rapid identification and susceptibility testing system against gram-negative clinical isolates. J Clin Microbiol 2001;39(8):2964-6.
  22. Lemos TC, Cogo LL, Maestri AC, Hadad M, Nogueira KDS. Is it possible to perform bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing with a positive blood culture bottle for quick diagnosis of blood stream infections? Rev Soc Bras Med Trop 2018;51(2):215-8.
  23. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH. Manual of clinical microbiology. 2003, 8th ed. American Society for Microbiology Washington, DC.
  24. Barenfanger J, Drake C, Kacich G. Clinical and financial benefits of rapid bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol 1999;37(5):1415-8.
  25. Doern GV, Vautour R, Gaudet RM, Levy B. Clinical impact of rapid in vitro susceptibility testing and bacterial identification. J Clin Microbiol 1994; 32(7):1757-62.
  26. Munoz-D�vila MJ, Yag�e G, Albert M, Garc�a-Lucas T. Comparative evaluation of Vitek 2 identification and susceptibility testing of gram-negative rods directly and isolated from BacT/ALERT-positive blood culture bottles. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012;31(5):663-9.
  27. Florio W, Barnini S, Morici P, Lupetti A. Direct inoculation of positive blood cultures using the Phoenix system for antimicrobial susceptibility testing of both gram-positive and gram-negative bacteria. J Med Microbiol 2015;64 (Pt 5):582-5.
  28. Barman P, Chopra S, Thukral T. Direct testing by VITEK� 2: A dependable method to reduce turnaround time in gram-negative bloodstream infections. J Lab Physicians 2018;10(3):260-4.

İletişim (Correspondence):

Uzm. Dr. Yasemin Gen� Bah�e,

Siirt Devlet Hastanesi,

Tıbbı Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Siirt,T�rkiye.

Tel (Phone): +90 484 224 81 61-15 10,

E-posta (E-mail): yasemingencbahce@gmail.com

Yazdır